仙台病毒P基因的原核表达及抗原性分析

根据GenBank公布的仙台病毒(SeV)磷蛋白(P)基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增P基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a中;重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后.转化感受态细胞BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达,获得相对分子量为99.6 ku的融合蛋白.经western blot及ELISA分析表明表达的融合蛋白具有良好的抗原性.     

鲤春病毒血症病毒核蛋白的原核表达及初步鉴定

为原核表达鲤春病毒血症病毒(SVCV)核(N)蛋白,本研究采用RT-PCR方法扩增SVCV N蛋白基因(SVCV-N),克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,并转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达.SDS-PAGE分析表明,SVCV-N基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物约47 ku,与预期相符.Western blot检测表明,该重组蛋白可以被SVCV阳性血清所识别.     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

将狂犬病病毒核蛋白(N)与麦芽糖结合蛋白(MBP)在大肠杆菌中融合表达。采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该重组融合蛋白的抗原性,并建立了间接ELISA方法检测狂犬病病毒特异性抗体。ELISA结果与快速荧光抑制试验(RFFIT)检测的中和抗体进行比较,RFFIT检测的中和效价与ELISA检测的OD值相关性很好(r=0.943 6),并且ELISA的敏感性和特异性分别为93.4%和100%。     

马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

禽流感病毒核蛋白基因的原核表达及其生物学活性分析

禽流感病毒(A v ian in fluenza v irus,A IV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染或/和疾病综合征[1,2],是被世界动物卫生组织(O IE)确定的I类烈性传染病。该病自1878年在意大利鸡群首次暴发以来,已对养殖业造成了严重的经济损失。近年来,我国各地及世界上许多国家都有禽流感     

蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及免疫原性鉴定

为获得蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)25型的VP7原核表达蛋白,本试验以蓝舌病病毒重组质粒为模板,PCR扩增VP7基因,将其克隆于pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达His-BTV-VP7蛋白。在变性条件下用镍亲和层析柱纯化His-BTV-VP7蛋白,经Western blotting及ELISA鉴定其免疫原性。结果显示,His-BTV-VP7蛋白以包涵体形式表达,大小约为40 ku;Western blotting和ELISA检测此原核表达蛋白能与山羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性。本研究为后续建立蛋白芯片检测方法奠定了基础。     

抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定

为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBV N蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和western blot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合.     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

仙台病毒F基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达及抗原性分析

为真核表达仙台病毒(SeV)融合蛋白(F)基因,本研究根据GenBank登录的SeV F基因序列设计合成一对特异性引物,以pMD18-T-F阳性重组质粒为模板扩增F基因,并将其克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac HTa中,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆粒rBacmid-F,经PCR鉴定正确将rBacmid-F转染Sf9细胞,连续传代后,细胞病变明显。经SDS-PAGE分析,成功表达了相对分子量为65ku左右的F蛋白,western blot和ELISA分析表明重组F蛋白具有良好的抗原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从细胞毒液中扩增N蛋白cDNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,所获得的重组质粒pET-28a-N经酶切鉴定正确后,将其转化入表达菌E.coliBL21plysS诱导表达,用SDS-PAGE与Western blotting对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为372 bp的N蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h蛋白表达量最高,出现分子质量约为18 ku的目的蛋白带,与N蛋白的理论值相符。经Western blotting检测,该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。获得的PRRSV N蛋白为建立针对该病毒抗体的间接ELISA检测方法,以及为进一步研发PRRS抗体检测试剂盒奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1的原核表达与免疫学检测

本研究采用原核表达载体pCold-HF在大肠杆菌中表达I型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus type Ⅰ,DHV-Ⅰ）弱毒株FC64株的VP1蛋白,经超声波裂解结果显示：VP1融合蛋白呈现可溶性表达。利用His-bindResin试剂盒纯化该产物,作为免疫原免疫小鼠,制备特异性抗体,进行免疫学检测。结果表明：该抗体与原核表达产物、DHV感染的SPF尿囊液总蛋白呈现特异性反应,这为DHV-Ⅰ快速诊断方法的建立奠定了基础。     

隐孢子虫P23基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather＇s蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及生物学活性鉴定

为研究猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的N蛋白特性及在诊断中的应用,本研究采用RT-PCR方法从猪流行性腹泻病毒FJ-11A株中扩增其N蛋白基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-32a上,构建原核表达重组质粒pET32a-PEDV-N,进行条件优化诱导表达、SDS-PAGE、Western blot和ELISA试验。结果表明,该重组目的蛋白（约60 kDa）得到表达,且具有良好的免疫学活性,该研究为开发猪流行性腹泻病毒诊断方法和研究N蛋白功能奠定基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定

根据I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)A66株vp3基因序列,设计了一对扩增vp3截短基因(-468bp)的特异性引物,将vp3截短基因与表达载体pET-32a(+)连接,构建了vp3截短基因的重组表达质粒pET-VP468。pET-VP468转入表达菌E.Coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中,使用IPTG诱导表达融合蛋白Trx-VP468。Trx-VP468经过Ni-NTA亲和层析柱和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化,SDS-PAGE电泳结果表明,pET-VP468在大肠杆菌中表达了一个相对分子量约为36kDa的蛋白,免疫印迹试验表明Trx-VP468得到了正确表达。该结果为VP3蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。     

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制

本研究首先利用同源重组一步克隆法将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体上,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析成功获得了重组蛋白rGST-VP3的表达.随即以纯化的重组蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞融合以及间接免疫荧光(IFA)筛选,获得2株稳定分泌CIAV-VP3抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亚型鉴定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均为IgG1;效价测定发现,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1:102400与1:12800;Western blot进一步证实,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别重组蛋白rGST-VP3.本研究结果为后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其诱导凋亡分子机制奠定了坚实的物质基础.     

新型鸭肝炎病毒VP1基因的序列分析及其原核表达

参照已公布的新型鸭肝炎病毒(new type Duck hepatitis virus,N-DHV)基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法成功扩增出N-DHV FJ01株VP1基因,经克隆测序后得到全长为720 nt的FJ01株VP1基因序列。将所得测序结果用DNAstar软件包MegAligntkg程序进行序列比对分析表明,N-DHV FJ01株与GenBank登录的韩国病毒株的同源率为94.2%~98.9%,与台湾病毒株04G和90D的同源率仅分别为72.3%和72.5%,与DHV-1病毒株DHV-HS和DRL-62的同源率仅分别为70.8%和70.7%;通过系统进化树可以发现韩国型与台湾型鸭肝炎病毒可分为2小群。本研究同时将N-DHVVP1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP1基因已成功地在大肠杆菌中得以表达。     

上海地区猪和奶牛血清中TTV（Torque Teno virns）感染的检测

于2009年3～5月采集上海地区的200份牛血清和400份猪血清,采用ELISA和荧光PCR方法检测其TTV（Torque Teno virus）感染状况。经ELISA检测,牛血清样品中检出阳性数2份,阳性率1．0％;猪血清样品中共检出阳性数15份,阳性率3．75％,其中生产母猪和育肥肉猪的阳性率分别为5．5％和2．0％,而荧光PCR检测结果均为阴性。结果表明上海地区猪和牛TTV感染现状处于较低水平。