番鸭细小病毒与鹅细小病毒的PCR鉴别诊断

通过比较基因ｂａｎｋ中番鸭细小病毒（ＭＤＰＶ）和鹅细小病毒（ＧＰＶ）的全基因序列,针对两种病毒非结构蛋白基因序列的相同区段,分别设计了两对ＰＣＲ引物ＬＨＭＰ／ＬＨＭＰ２和ＬＨＧＰ１／ＬＨＧＰ２,用这两对引物分别对ＭＤＰＶ和ＧＰＶ进行检测,其结果引物ＬＨＭＰ１／ＬＨＭＰ２只特异性地扩增ＭＤＰＶ,而引物ＬＨＧＰ１／ＬＨＧＰ２也只特异性地扩增ＧＰＶ,并且两对引物均扩增出约７２０ｂｐ的长度序列。     

肉食兽细小病毒核酸探针的制备及其初步应用研究

将提纯的貂肠炎病毒(MEV)中间复制型DNA(RF-DNA),以HinaⅡ酶切,回收0.7kbC片段并克隆至质粒pBR322中,构成重组质粒pBM,经转化大肠杆菌RRⅠ并扩增后,提纯pBM,酶切电泳回收克隆的C片段,以[α-32P]dATP标记C片段和pBM,用光生物素标记pBM,分别制成放射性同位素和光生物素核酸探针。采用打点杂交技术检测了5种肉食兽细小病毒的细胞培养物和非细小病毒科5种病毒的细胞培养物,同时检测了貂和犬的粪便样品33份。结果表明,32P标记的C片段和pBM探针与光生物素际记的pBM探针均具有相同的杂交特异性,与5种肉食兽细小病毒及感染细小病毒的貂、犬粪样呈杂交阳性反应,与其他科病毒及健貂、犬粪样呈阴性。同位素32P和光生物素标记探针分别检出1 pg和10 pg貂肠炎病毒RF-DNA,敏感性比血凝试验分别离100倍和10倍。     

鹅细小病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)基因序列,分别设计合成针对GPV非结构蛋白(NS)和MDPV NS2-VP1基因片段的2对引物GPV U/L和MDPV U/L,将GPV和MDPV提取核酸混合后作为模板,优化PCR反应条件,建立了能同时检测这2种病毒的双重PCR。特异性试验结果显示,引物GPV U/L仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株730bp核酸片段,引物MDPVU/L仅特异性扩增出MDPV的624bp核酸片段,双重PCR扩增出长度分别为730bp和624bp的2条特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)和鹅副黏病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,双重PCR能同时检测到14.4pg的GPV核酸和28.8pg的MDPV核酸。结果表明,建立的双重PCR可用于GPV和MDPV的鉴别诊断和联合检测。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1／R1和GPVF1／R1，建立了一种PCR方法，用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒（DPV）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、犬细小病毒（CPV）和猫泛白细胞减少症病毒（FPLV）的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果，引物MDPVF1／R1仅特异性扩增出MDPV的900bp核酸片段，引物GPVF1／R1仅特异性扩增出GPV的465bp核酸片段。表明，建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒(GPV)B株的全基因序列，针对GPV的VP3保守基因设计了1对引物，建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约441bp的特异性片段，而对鸭瘟病毒(DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌(E．coli)Os和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达0．47pg；对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明。感染后8h即可从心、肝病料中栓出病毒DNA，感染后24h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中栓出GPVDNA，感染48h后可从骨髓中检出病毒DNA，感染312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性，对，临床送栓病料的检测结果表明，PCR的敏感性显著高于病毒分离。     

鸭瘟病毒、鹅细小病毒和番鸭细小病毒三重PCR检测方法的建立

为建立鉴别鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的多重PCR检测方法,参考文献合成针对DPVUL6基因、GPVNS基因和MDPVVP1基因序列的特异性引物。通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。结果显示,该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性,表明特异性较强;DPV、GPV和MDPV的最低核酸检出量分别为237.3pg、22.45pg和204.6pg,表明敏感性良好;该方法对DPV+GPV+MDPV、DPV+GPV、DPV+MDPV、GPV+MDPV、DPV、GPV和MDPV的核酸均能扩增出与预期大小一致的目的条带,表明该多重PCR方法重复性较好。本研究方法具有特异性强、敏感性良好、重复性较好和快速简便等特点,可用于DPV、GPV和MDPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。     

猪细小病毒PCR检测方法的建立及应用

根据已报道猪细小病毒基因组序列,设计合成了一对特异引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,确定PCR检测的最佳条件,成功扩增出预期的1980bp片断。特异性和敏感性试验结果发现:该方法特异、敏感,可以检测到0.9TCID50、0.001个HA的病毒。用该方法对用ZH株免疫妊娠母猪后第7、14、21天血液及胎儿样品进行检测,在血液和所采组织样品中均未检测到PPV病毒抗原,说明ZH株免疫后不产生病毒血症,也不能通过胎盘垂直传染给仔猪。     

犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测

根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV) VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断.结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342 bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4 pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸捡测结果进行比较,吻合率为90.0％.将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3％.大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚.     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

根据已报道的猪细小病毒基因组序列，设计并合成了1对寡核苷酸引物，通过对影响PCR扩增因素的筛选，成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段，回收该片段用EcoR I酶切得到了预期的结果，证实了该扩增片段的特异性。敏感性试验表明，该方法可以检测出10^-4个TCID50的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病科的检测，查出阳性16份，而同时利用HA检测阳性只有10份。这些结果说明本试验建立的PCR诊断方法灵敏度高、特异性强。     

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。     

副鸡嗜血杆菌PCR检测方法的建立

参照GenBank中已发表的副鸡嗜血杆菌血凝素（HA）基因设计合成了一对引物,预计扩增片段大小约为412bp。利用这对引物,通过对PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对副鸡嗜血杆菌的PCR检测方法。结果表明,该方法敏感性较高,最低可检出1．7×10^4CFU／mL的副鸡嗜血杆菌,对副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌在相同反应条件下未扩增出任何片段,说明该方法具有较好的特异性。     

鸡细小病毒半巢式PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的方法,根据ChPV的保守基因NS1设计了3条特异性引物,建立并优化了能快速检测ChPV的半巢式PCR方法,对其进行特异性和敏感性试验,并用所建立的方法对48份临床样品进行了检测。特异性和敏感性试验结果显示,建立的半巢式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为186 bp的特异性条带;其最低能检测到5.62 fg/μL的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。临床检测结果显示,同时对48份临床样品进行检测,检出率为16.67%（8/48）,提示广西区内鸡群存在ChPV感染。本研究建立的ChPV半巢式PCR方法适用于ChPV的临床检测。     

Development and Preliminary Application of a Semi-nested PCR Assay for Detection of Chicken Parvovirus

In order to set up and optimize a semi-nested PCR for rapid detection of chicken parvovirus (ChPV), three specific primers were designed according to conserved sequences of NS 1 gene of ChPV. The specificity and sensitivity of ChPV semi-nested PCR were tested, and the assay was applied to detect 48 clinical samples. The specificity and sensitivity tests showed that this semi-nested PCR was only sensitive to ChPV for amplifying specific band of 186 bp and it could detect 5.62 fg/μL of ChPV DNA, without any sensitivity to other viruses, such as Newcastle disease virus, H9 subtype avian influenza virus, Marek's disease virus, infectious laryngotracheitis virus and infectious bronchitis virus. 48 chicken samples were detected and the positive rate was 16.67% (8/48). The results of our study demonstrated that the optimized semi-nested PCR could be a method that was suitable for clinical detection of ChPV.     

犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)基因序列各设计了一对引物,经试验条件的优化,建立了检测CPV的PCR方法和CCV的RT-PCR方法,扩增目的片段大小分别为337 bp和852 bp.在此基础上建立了检测CPV和CCV双重PCR方法.该双重PCR方法能特异的扩增CPV和CCV,且分别扩增出1...     

聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的研究

本研究依据编码猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,合成了一对寡核苷酸引物,通过减少病毒核酸的提取时间、费用及优化聚合酶链式反应(PCR)的条件,成功地从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中扩增出预期的158 bp片段,经EcoRⅠ酶切鉴定,证实了该扩增片段的特异性.经敏感性试验测定,PCR的最低检出量为0.008病毒血凝(HA)单位.这些结果表明本试验建立的PCR对PPV的检测人有快速、简便、经济、灵敏度高和特异性强的特点.     

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。