Efficient Site-directed Mutation of Porcine IGF2 Gene via Base Editors

This study was aimed to efficiently and accurately edit the growth trait-related gene insulin-like growth factor 2 (IGF2) in porcine fetal fibroblasts cells (PFFs) of Bama pigs using base editors.The IGF2 gene sequences of Bama pigs and Large White pigs were identified by PCR amplification and sequencing,and the expression vector of sgRNA-IGF2 targeting Bama pigs was constructed.Then the editing efficiency and product types at IGF2 gene via different base editors were studied by cell transfection,detection of mixed cell editing efficiency,screening of single cell colonies and genotyping.The results showed that there was a single nucleotide polymorphism (SNP) site at 3 072 bp in intron 3 of IGF2 gene between Bama pigs and Large White pigs,and a single-stranded oligonucleotide sequence targeting the IGF2 gene was designed.The single-stranded oligonucleotide was annealed and ligated with the BsaⅠ-linearized pGL3-U6-sgRNA plasmid to construct the sgRNA-IGF2 expression plasmid.The sequencing results of the recombinant plasmid showed that the sgRNA sequence was accurately inserted between the U6 promoter and the sgRNA scaffold.Four different cytosine base editors (rA1-BE3,hA3A-BE3,hA3A-BE3-Y130F and hA3A-eBE-Y130F) were co-transfected with sgRNA-IGF2-expressing plasmid into PFFs,respectively.The editing efficiency in mixed cells showed hA3A-BE3-based CBEs could introduce higher efficiency of C-to-T mutation than rA1-BE3 (P<0.05).The results of flow cytometry,single cell culture and genotyping showed that 71.43% of single cell colonies were mutant in hA3A-BE3 group,but 42.86% of them had insertions/deletions (indels).The editing efficiency of hA3A-BE3-Y130F (56.86%) and hA3A-eBE-Y130F (40.38%) were lower than hA3A-BE3(71.43%),but the indels of them were also lower (31.37% and 21.15%).In addition,single cell colonies with homozygous mutation at IGF2 gene site were achieved by base editors in this study.Base editors,as new gene editing tools,could efficiently and accurately modify SNP associated with economic traits in pig genome and accelerate genetic improvement.     

利用单碱基编辑器定点突变猪肌肉生长抑制素基因的研究

【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。     

单碱基水平上胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的研究进展

尽管新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点,但在执行单个碱基水平的突变时其效率往往很低。由于DNA的双链断裂具有很多的不确定性,又加上基于供体模板的同源末端重组（homology directed repair,HDR）仅仅发生在分裂活跃的细胞中,而非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）在整个细胞周期中都可以发生,因此,传统CRISPR/Cas9在单碱基分辨率上进行基因编辑时存在一定弊端。碱基编辑器（base editor,BE）的出现则在一定程度上弥补了这一缺陷。胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor,CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor,ABE）都能够在不引起双链断裂的情况下实现C·G到T·A或A·T到G·C的转换,极大地提高了单碱基编辑的应用价值。本文侧重对出现较早的CBE的原理、发展、应用及存在的问题进行综述,以期为高效单碱基突变工具在生物医学和畜牧业生产中的应用提供有益的参考和借鉴。     

猪IGF2基因多态性研究

该研究分析了猪胰岛素样生长因子2(IGF2)基因内含子3的3 072位点在大白、长白、杜洛克3个品种中的多态性,并分析不同基因型与100 kg体重日龄和背膘厚的关系。结果表明,在3个品种中均存在A、G基因型,且A基因型为优势基因型。3个品种中A基因型个体背膘厚显著低于G基因型个体(P0.05),而不同基因型间100 kg体重日龄无显著差异。结果提示IGF2可作为脂肪沉积的候选基因应用于标记辅助选择。     

绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立

研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子,获得定点编辑类型的绵羊胚胎,为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA （single guide RNA,sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1~sgRNA-T4）,构建4组不同的重组表达载体;将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞,随后用Cruiser^TM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示,sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被Cruiser^TM酶酶切,且测序结果表明都具有靶向效果,编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中,并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率,结果显示,胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max （ng/μL）∶sgRNA （ng/μL）=100∶50,从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示,引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子,通过在成纤维细胞转染表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA （T1、T4）;通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎,成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变,为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。     

猪肺炎支原体SC株P46基因的定点突变

猪肺炎支原体P46基因中有3个密码子TGA用于编码Trp而非终止密码子,为了在原核表达系统中进行猪肺炎支原体P46基因的根表达,根据其序列设计了3对引物,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法将编码密码子TGA同义突变为TGG.将突变后的P46基因克隆至pEasy-T载体中,并进行测序.测序结果表明将P46基因中的TGA密码子突变为TGG很成功.     

猪IκBα基因定点突变中两种方法的应用

作者将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸,为进一步研究突变型IκBα蛋白对异种移植延缓性排斥反应的抑制机理奠定基础。首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。说明两种突变方法各有所长,又有各自的缺点,应根据试验的实际需要灵活选择合适的突变方法,以收到事半功倍的效果。     

猪嗜血支原体OxaA基因的同义定点突变、克隆及在Vero细胞中的表达

为真核表达猪嗜血支原体(Mycoplasma suis)膜蛋白OxaA基因,本实验采用PCR技术扩增包含OxaA基因全长在内的1 561 bp序列,通过引物突变法对OxaA基因内部的两个编码蛋白障碍的碱基进行同义定点突变,应用Overlap PCR技术将3对引物扩增得到的OxaA片段进行拼接,获得能够正确翻译膜蛋白的OxaA基因序列,将鉴定正确的pVAX-OxaA重组质粒转染Vero细胞,应用IFA和western blot方法鉴定OxaA基因在Vero细胞中的表达.结果显示,突变的OxaA基因经Overlap PCR扩增获得长度为747 bp的基因片段,与GenBank中M.suis基因组的核苷酸序列同源性为98％,IFA检测OxaA基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为29 ku,具有较好的反应原性.本实验首次在真核细胞中表达了M.suis的QxaA基因,为M.suis基因疫苗的研究奠定了基础.     

苏淮猪肌内脂肪表型测定及其与IGF2和SCD基因的多态性关联性分析

为了对苏淮猪肌内脂肪含量特征进行评估以及筛选适宜提高苏淮猪肌内脂肪含量的分子标记,屠宰测定体重在(87.61±0.54)kg共314头苏淮猪的肌内脂肪含量,并分析肌内脂肪候选基因标记IGF2基因第3内含子3072AG位点和SCD基因g.2228TC位点在苏淮猪群体的多态性及其与苏淮猪肌内脂肪性状的关联性。结果显示:苏淮猪群体肌内脂肪含量为(1.99±0.04)%,变异系数为37.13%。其中,阉公猪肌内脂肪含量高于母猪肌内脂肪含量,但公母间差异不显著。在IGF2基因中,A等位基因和G等位基因的基因频率分别为0.403和0.597;AA型基因型频率为0.175,AG型为0.455,GG型为0.370;不同基因型之间苏淮猪肌内脂肪含量无显著差异。在SCD基因中,C等位基因与T等位基因的基因频率分别为0.417和0.583;CC型基因型频率为0.169,CT型为0.497,TT型为0.334,不同基因型之间苏淮猪肌内脂肪含量无显著差异。IGF2和SCD基因合并基因型与苏淮猪肌内脂肪含量无显著相关。IGF2和SCD基因的多态位点与苏淮猪的肌内脂肪性状不相关,因此不能作为提高苏淮猪肌内脂肪含量的分子标记。     

猪IGF2基因G3072A位点多态性及其与大白猪初生重和早期生长的关系

本研究采用PCR-SSCP技术对猪胰岛素样生长因子2（IGF2）基因G3072A位点在大白、长白和杜洛克猪群体的单核苷酸多态性（SNP）进行了检测，对其与大白猪初生重和早期生长的关系进行了分析。结果表明，在所分析的大白、长白和杜洛克猪群体的511个体中，IGF2基因在该位点均呈现多态性，大白、长白和杜洛克猪群体AA、AB和BB基因型均有分布，且大白和长白猪群体均显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P〈0．01），而杜洛克猪群未偏离Hardy-Weinberg平衡（P〉0．05）。测序结果显示，等位基因A和B分别对应于核苷酸A和G，在A等位基因中，有（AG）二核苷酸的插入。关联分析表明，在大白猪群中，AA、AB和BB基因型个体的初生重差异显著（P〈0．05），AA和AB基因型个体的21、28和70日龄体重以及从出生～21日龄、21～28日龄、28～70日龄的日增重差异不显著（P〉0．1）。     

杜大长猪IGF-I基因的克隆及其序列分析

采用ＴＲＩzol法从杜大长杂交猪的肝脏中提出总ＲＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板 ,以设计的Ｐ１（５′－ＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣ－３′）为引物合成ＩＧＦ－Ｉ基因cＤＮＡ的第１链,再以Ｐ１和Ｐ２（５′－ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴ－３′）为引物扩增到大小约为３６０bp的产和,并将其达隆至pＧＥＭ－Ｔ载体上。经筛选、酶切、我分析,表明该片段为ＩＧＦ－Ｉ基因的cＤＮＡ     

猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化

本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞.利用乳腺细胞堵养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞.结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞.上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚,比较明显.成纤维细胞呈长梭形.结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达.     

卵泡抑素基因过表达对其通路上相关基因表达的影响

为了探讨过表达卵泡抑素(follistatin,FST)基因对其通路上相关基因表达量的影响,本研究采用PCR方法扩增了民猪的FST基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Dsig-FST,对转染了重组质粒的成纤维细胞进行了鉴定,并采用实时荧光定量PCR检测通路上相关基因表达量的变化。结果表明,本研究成功克隆了民猪的FST基因,并在猪胎儿成纤维细胞中显著过表达,结果导致了ActRⅡB和BMP4基因显著下调 (P<0.05),Smad4和Myostatin基因有下调趋势,ActRⅡA基因有上调趋势。由此可见,FST基因的表达变化对其通路上部分相关基因的表达有不同程度的抑制或促进作用。     

EGF和FGF-2对猪皮下脂肪神经嵴干细胞增殖和分化的影响

【目的】探究表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF-2）对猪皮下脂肪神经嵴干细胞（neural crest stem cells,NCSCs）增殖及分化的影响,以优化猪皮下脂肪神经嵴干细胞的培养条件。【方法】通过体外分离培养原代猪皮下脂肪NCSCs,免疫荧光染色鉴定NCSCs标志物p75 NTR,并用不同浓度的EGF和FGF-2（0和0、10和10、10和20、20和10、20和20、30和30 ng/mL）作用于传代猪皮下脂肪NCSCs,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖率,确定细胞生长的最适EGF和FGF-2浓度,将试验分为空白组和最适浓度组,测定两组细胞的生长曲线,成脂化诱导后油红O染色,对比两组细胞的脂滴生成量。【结果】免疫荧光染色结果显示,原代猪皮下脂肪NCSCs经p75 NTR鉴定呈阳性。CCK-8细胞增殖试验结果显示,EGF和FGF-2的浓度均为20 ng/mL时对传代猪皮下脂肪NCSCs的促增殖作用最佳。生长曲线显示,两组细胞均在第5~9天处于对数生长期,第10~15天细胞增殖减缓,逐渐到达停滞期。油红O染色结果显示,最适浓度组胞质内的脂滴生成量远多于对照组。【结论】在培养液中添加20 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF-2对猪皮下脂肪NCSCs的增殖和分化有促进作用。     

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪细小病毒SY-99株VP2基因的序列分析

克隆并测定猪细小病毒SY－99株VP2基因，与NADL－2（4973）株、NADL－2（5075）株、Kresse株和US－1株VP2基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较与分析，发现PPV SY－99株与Kresse株VP2基因核苷酸和氨基酸同一性最高，推测SY－99株可能为一强毒株。