龙眼体胚发生过程中RNA甲基化相关基因全基因组鉴定及表达分析

为了解龙眼RNA甲基化相关基因的生物学功能,本研究基于基因组和转录组数据,采用生物信息学分析方法,进行龙眼基因组RNA甲基化相关基因成员鉴定,蛋白结构域及特性分析,分子进化树分析,体胚发生过程和组织器官基因表达水平分析以及ABA处理下的定量表达分析。结果显示：龙眼中有7个参与RNA甲基化过程中的关键基因,包括5个RNA甲基转移酶基因和2个去RNA甲基化酶基因;各成员内含子数量差别较大,为4~28个不等;进化树分析显示,龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白与甜橙亲缘关系最近;蛋白结构域分析显示,RNA甲基化相关酶具有保守的蛋白结构域;龙眼RNA甲基化相关基因启动子区域中主要含有光响应功能元件、激素响应功能元件、胁迫响应功能元件和分生组织表达响应元件,推测RNA甲基化相关基因可能对植物的生长发育和适应不良环境有一定调节作用;RNA甲基化相关基因部分成员在龙眼体胚不同发生阶段和不同组织器官中的表达有明显区别,推测龙眼RNA甲基化相关基因可能参与不同体胚发育阶段和组织器官形态建成;不同浓度ABA处理下,龙眼EC中RNA甲基化相关基因的表达情况各异,其中DlVIR、DlALKBH10B和DlMTB的相对表达量受到一定的抑制作用,而DlFIP37则呈现上调表达,暗示龙眼RNA甲基化相关基因参与激素响应途径。本研究表明,龙眼RNA甲基化相关基因除了可能在叶的形成、花的发育和植株的形态建成等方面发挥重要的作用外,还可能参与调控胚胎发育和响应非生物胁迫,推测龙眼RNA甲基化相关基因成员在功能上具有差异性和多样性。     

龙眼体细胞胚胎发生过程中的内源激素变化

采用HPLC法测定了龙眼“红核子”品种胚性愈伤组织胚胎发生过程中各个不同发育阶段的内源激素含量变化。结果表明,龙眼胚性愈伤组织中内源激素含量比非胚性愈伤组织高;除GA3外,体胚发生过程中内源激素变化趋势大致呈“M”状:胚性愈伤组织Ⅱ和球形胚为变化的2个明显转折点;内源激素的变化先于形态学的变化。      

龙眼体胚发生过程中两个乙烯受体基因的定量表达分析

以龙眼体细胞胚胎发生8个不同发育阶段同步化胚性培养物为材料,采用荧光定量PCR方法,分析两个乙烯受体基因(DL-ETR1和DL-ERS1)的mRNA动态变化水平。试验结果表明:DL-ETR1表达量整体的变化趋势呈近似"W"状,松散型的胚性愈伤组织(Stage 1)的表达量最高,心形胚(Stage 6)阶段的表达量最低;龙眼体胚发生过程的8个阶段均有DL-ERS1基因的表达,子叶形胚(Stage 8)的表达量最高,其它7个阶段的表达量都很低,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量极低,几乎不表达。DL-ETR1与DL-ERS1有着不同时期的表达模式,并且可能起到结合乙烯,调节龙眼体胚对乙烯敏感性的综合作用。     

龙眼胚性悬浮细胞原生质体培养及其体胚发生再生植株

以“红核子”、“东壁”、“十二月龙眼”等龙眼品种的胚性悬浮细胞为起始材料分离原生质体,采用液体浅层培养、包埋悬浮培养等方式,进行原生质体培养与植株再生研究。研究结果表明,海藻酸钙包埋悬浮振荡培养(50r/min)是龙眼悬浮细胞原生质体培养的适宜培养方式,在含有多种生长调节剂的改良MS培养基(MP6)上,再生小克隆的形成频率可高达5%;采用龙眼胚性愈伤组织体胚诱导、成熟和萌发的优化方案,原生质体再生小克隆分化子叶形胚状体的频率达100%,萌发植株的频率一般大于45%。      

常绿果树体细胞胚胎发生体系研究进展

通过总结国内外常绿果树体胚发生体系研究现状,介绍了体细胞胚胎发生体系的建立,综述了体细胞胚胎发生过程的主要影响因素、生理生化机制及遗传稳定性的研究进展,提出目前体细胞胚胎发生体系研究存在的问题和今后展望,以期为今后常绿果树体胚发生体系研究及实际应用提供参考价值。     

龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-4的克隆与表达分析

以龙眼（Dimocarpus longan Lour.）胚性培养物为材料,采用简并引物结合RACE方法分离得到龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-4的cDNA全长序列,全长为1 061 bp,由735个核苷酸组成的开放阅读框,编码244个氨基酸（GenBank登录号为GQ443758）。采用生物信息学方法分析,发现该基因推导的蛋白分子量为28 576 ku,pI为9.96;该蛋白为60S Ribosomal protein L30蛋白质家族成员中的L7蛋白,是一个具有核糖体蛋白L30信号位点和1个典型的Ribosomal L30 like superfamily组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;α螺旋是该蛋白最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。实时荧光定量PCR分析结果显示,DlUP-4基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其表达水平的趋势呈“M”形,其中2个高峰出现在不完全胚性紧实结构阶段和鱼雷形胚阶段,而球形胚阶段最低。该研究结果对DlUP-4基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼体胚发生过程中,在调控体胚发生的启动、细胞的极化、细胞的增殖等方面可能有重要的功能,这为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树的次生体细胞胚胎发生—— 一种新的长期性体细胞胚胎发生诱导方法

在橡胶树中,以未成熟种子的内珠被为外植体通过其胚性愈伤组织的继代增殖可以持续不断地诱导体细胞胚胎,该方法称为持久体细胞胚胎发生(Maintained Somatic Embryogenesis,MSE)。然而,直接利用内珠被组织诱导易碎型胚性愈伤组织系不但频率很低,而且迄今仅无性系PB260和RRIM703能够藉此途径实现体细胞胚胎的长期诱导。本研究以体细胞胚胎为外植体成功诱导和建立可增殖胚性愈伤组织系。组织学分析显示,体胚外植体切口边缘表皮及周维管细胞脱分化导致易碎型胚性愈伤组织的产生。所获愈伤组织经继代增殖和筛选最终得以建立胚性愈伤组织系。该新方法被称为间接次生体细胞胚胎发生(Indirect Secondary Somatic Embryogenesis,SSE)。我们还就体胚及内珠被2种外植体诱导胚性愈伤系的潜力进行了深入比较。结果表明,采用体胚外植体诱导胚性愈伤组织系其频率明显高于内珠被外植体。除了PB260和RRIM703之外,我们通过SSE途径还成功建立了无性系PB217的胚性愈伤组织系,而该无性系之前一直难以用MSE法获得其胚性愈伤系。此外,采用SSE法建立胚性愈伤系所需继代培养的次数也大为减少。对于不少仅实现初生体细胞胚胎发生的无性系而言,该方法无疑为其长期性体胚发生的诱导开辟了一条新的途径。     

提高陆地棉体细胞胚胎发生和再生植株率的研究

试验就提高陆地棉体细胞胚胎发生频率和胚状体质量进行了深入的研究；对再生植株的微繁技术进行了初步的探讨。我们认为在棉花育种实践中进行快速繁殖以及杂种优势的固定具有一定的利用价值。     

龙眼体细胞胚胎发生早期SDG基因家族的全基因组鉴定与表达分析

SET domain group（SDG）基因家族控制的组蛋白赖氨酸甲基化,是参与染色质功能调控和表观遗传调控基因表达的重要部分。为了解龙眼（DlSDG）家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼全基因组SDG家族成员的鉴定,并对蛋白质结构域、保守基序、基因结构、启动子顺势作用元件、进化树、相关基因的蛋白互作和体胚发生早期的基因表达情况进行预测和分析。结果显示,龙眼SDG家族基因包括32个成员,分为Suv、Ash、ATXR5/ATXR6、Trx、E(z)、SMYD和SETD 7个亚家族,其中Suv亚族成员数量最多;外显子数量在1~22个不等,蛋白结构域保守,都含有一个SET结构域,DlSDG蛋白保守motif不同亚家族间差异较大;DlSDG启动子包含许多诸如低温、干旱和压力等非生物胁迫响应元件和激素响应元件;龙眼SDG成员在体胚发生早期均能不同程度表达,其中DlSUVR4b在EC和ICpEC阶段可能发挥着较为重要的作用;DlSUVH4可以和DNA甲基转移酶MET1发生互作。本研究表明,龙眼DlSDG 32个组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因可能除了在生物钟的调节、植物发枝数量、根的生长发育、种子的萌发、花的发育和植株的形态建成等方面发挥重要功能外,也可能直接参与胁迫响应和体细胞胚胎发生的调控,并且还可能在参与DNA甲基化、染色质重塑的过程中形成体细胞胚胎发生的协作调控网络,表现其具有功能上的多样性、复杂性。     

龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆及其生物信息学分析

植物Ran蛋白与核质运输、微管形成等过程密切相关。通过Tail-RCR结合接头连接介导PCR法克隆了龙眼胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC)Ran家族DlRan3A和DlRan3B基因的5′调控序列,长度分别为1276和714 bp。结合生物信息学法,分析启动子的转录起始位点和顺式作用元件。结果表明:龙眼EC DlRan3A和DlRan3B基因启动子分别存在1处和3处转录起始位点,且除了含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还含有多个光响应元件、激素应答元件、防御与逆境胁迫响应元件等。龙眼EC DlRan3A和DlRan3B启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导,在龙眼体胚发生过程中的信号转导应答过程中发挥重要作用。此外,在DlRan3A启动子区预测到1个长度为214 bp的CpG岛,为后续研究该基因启动子甲基化水平及分子调控机制提供了线索。龙眼EC Ran基因启动子的克隆与生物信息学分析有助于揭示Ran在体胚发生过程中的作用。     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生的同步化调控及其DNA与RNA的提取方法

过改进培养基的配方,控制2,4-D和蔗糖浓度以及培养时间,获得了龙眼胚性愈伤组织体胚发生各个阶段即球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚、成熟体胚等阶段高度同步化的胚性培养物;对龙眼胚性培养物进行了DNA、RNA提取方法研究,获得了完整、高质量的DNA和RNA,摸索出一套简便、快捷、有效的DNA提取方法,并对提取的RNA进行了反转录及PCR扩增试验,为龙眼体细胞胚胎发生的分子生物学研究奠定了重要基础。      

龙眼MSIL全基因组鉴定及表达分析

MSIL（Muliticopy suppressor of IRA homolog1-Like）基因是WD重复蛋白的一个亚家族,在植物生长发育过程中发挥重要的作用。为了解龙眼MSIL（DlMSIL）基因家族的生物学功能,本研究基于基因组和转录组数据,采用生物信息学分析法对DlMSIL基因成员进行鉴定,并进行蛋白质结构及理化性质分析、系统发育进化树构建、启动子顺式作用元件分析、龙眼体胚阶段和不同组织器官表达情况以及GA₃处理下的定量表达分析。结果表明：DlMSIL基因家族含有6个成员属于WD40和CAF1C_H4-bd超家族,可分为3类;DlMSIL蛋白编码393~551 aa,等电点为4.68~7.62,该家族成员均不属于分泌蛋白;基因家族成员的内含子数目在4~14之间;DlMSIL启动子序列包含大量非生物胁迫响应元件及MYB结合位点,推测DlMSIL基因家族可能参与多种非生物胁迫反应;DlMSIL可能参与不同胚胎的发育过程和不同组织器官的形态建成。GA₃处理下的表达分析显示高浓度时,DlMSI1a与DlMSI1c的表达受到了一定的抑制,而DlMSI4a的表达量呈现先下降后上升再下降的趋势,推测DlMSIL可能参与激素响应途径。本研究表明,DlMSIL基因家族成员可能参与胚胎发育、激素信号通路以及非生物胁迫反应等多种生物学功能,体现了龙眼MSIL基因家族功能具有多样性。     

龙眼HD-Zip基因家族生物信息及表达分析

为了解龙眼HD-Zip基因家族的功能,本研究基于龙眼基因组与转录组数据库,对提取的19个龙眼HD-Zip家族成员的启动子、可变剪接以及受到调控的miRNA种类进行分析;并采用实时荧光定量PCR技术,分析了在ABA处理下龙眼胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中HD-Zip部分成员的表达模式,以及HD-Zip部分成员在不同体胚阶段的表达模式。结果表明：龙眼HD-Zip家族除含有TATA-box和CAAT-box以外还含有大量的光响应元件、激素响应元件以及胁迫响应元件,暗示龙眼HD-Zip家族成员可能参与光反应、激素响应以及非生物胁迫的过程;龙眼HD-Zip在不同组织部位与不同体胚阶段的可变剪接方式主要以内含子保留为主;龙眼HD-Zip基因家族成员主要受到miRNA166a的调控;在外源激素ABA处理下龙眼EC中HD-Zip家族部分成员的表达模式以及部分成员在不同体胚阶段的表达模式都呈现多样化,推测龙眼HD-Zip参与龙眼不同体胚发育的调控,并且可能通过调节内源ABA的浓度进而影响胚性愈伤组织的生长发育以及形态的建成。     

龙眼2个品种花部特征比较研究

研究龙眼石硖和储良2个品种的花部形态、开花生物学特性、花粉形态特征及萌发率、花粉量、P/O值、柱头可授性及其黏液分泌情况。结果显示,二者花部特征相似,储良花期较石硖长;二者的花粉形态相似,储良的花粉较石硖稍大,萌发率较石硖高;P/O值说明龙眼为专性异交植物;石硖和储良花粉活力和柱头可授性是同步变化的,尤其在盛花期花粉活力趋于最大,柱头分泌黏液与柱头可授性变化也一致,都在柱头展开成水平,开花约48 h达到最大。     

龙眼DlICE1基因克隆及低温胁迫表达分析

本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料,根据龙眼转录组数据库,采用RACE-PCR和RT-PCR技术获取龙眼DlICE1 cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析与低温胁迫下表达分析。结果表明,龙眼DlICE1 cDNA全长为2327 bp,其中开放式阅读框（ORF）序列长1614 bp,共编码537个氨基酸。生物信息学分析表明,龙眼DlICE1编码的蛋白质属于不稳定的弱酸性蛋白,不具有典型的信号肽,且不属于分泌蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,与甜橙的同源蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR表明,龙眼DlICE1能够有效响应低温胁迫,低温诱导其表达量提高。研究结果显示,龙眼DlICE1基因参与龙眼胚性愈伤组织抗寒过程。     

龙眼胚性愈伤组织DlHOS1基因克隆与表达分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE-PCR技术对植物抗寒重要调控因子HOS1(DlHOS1)进行克隆,并进行密码子使用偏爱性、生物信息学和低温胁迫下表达等方面的分析。结果表明:DlHOS1基因序列全长3 577 bp,包含ORF 3 000 bp,编码999个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别162 bp和415 bp(GenBank登录号:KY990404);密码子使用偏爱性分析表明,DlHOS1密码子的选择偏爱性较弱,偏爱以A/T结尾;生物信息学分析结果表明,DlHOS1编码的蛋白属于不稳定的疏水性跨膜蛋白,不含信号肽,定位于细胞质和细胞核,二级结构富含α螺旋,与柑橘的亲缘关系较近;qPCR结果发现,DlHOS1能够响应低温胁迫诱导,总体上低温下其表达水平上升。研究结果认为,DlHOS1参与龙眼抗寒和低温胁迫过程。      

龙眼单细胞培养及其体胚发生再生植株

以龙眼松散型胚性愈伤组织(CⅢ类型)为起始材料。进行了单细胞培养及其体细胞胚胎发生再生植株的研究。结果表明：由CⅢ类型胚性愈伤组织建立起的分散性良好的悬浮细胞系，经过孔径(φ)为40μm的尼龙网过筛。可以获得单细胞悬浮系：采用液体浅层培养。部分单细胞可持续分裂，并且有规则分裂和不规则分裂2种方式。前者可能直接形成体细胞胚胎，后者则先形成多细胞团再形成体胚；在液体浅层培养中．单细胞可不经转移直接形成子叶形体细胞胚胎：这些体细胞胚胎经过成熟培养后，可萌芽生根再生完整植株。     

龙眼体胚发生早期4CL基因家族鉴定与功能分析

为了解龙眼4-香豆酸:辅酶A连接酶(Dl4CL)基因家族的分子特性及生物学功能.采用生物信息学分析方法进行龙眼4CL基因家族的成员鉴定,蛋白结构域及特性、分子进化树、体胚发生过程和组织器官中的表达规律分析以及可能互作的miRNA预测.结果显示,Dl4CL基因家族包含43个成员,分为6个亚家族;不同亚家族成员的基本理化性...