Construction and Identification of Brucella WadC Gene Deletion Strain

The purpose of the test was to analyze the role of the glycosyltransferase-encoding gene WadC in affecting the intracellular survival of Brucella.Using the Brucella sheep Rev.1 genome as template,the fusion fragments of the homologous arms of the upper and lower arms of WadC gene were obtained by homologous recombination,and ligated to the vector pUC19-SacB to construct the pUC19-SacB-ΔwadC recombinant vector,which was transferred to sheep species Brucella Rev.1,constructing a ΔwadC deletion strain (Rev.1ΔwadC),testing the genetic stability of the strain Rev.1ΔwadC,comparing and analyzing the growth characteristics of the parental strain Rev.1 and the deletion strain Rev.1ΔwadC and the BMDC and RAW264.7 viability of cells.The results showed that the gene-deficient strain was successfully constructed in the experiment,and no genetic back mutation was found in 30 consecutive passages.Under the same culture conditions in vitro,the growth trend of the deleted strain Rev.1ΔwadC was similar to that of the parental strain Rev.1,and both reached logarithmic growth period at 20 h and reached plateau period at 44 h.When the BMDC cells were infected at 48 and 72 h,the intracellular survival rate was significantly lower than that of the parent strain (P<0.05).The RAW264.7 macrophage test of infected mice showed that the parent strain had no significant difference with the gene deletion strain (P>0.05).To sum up,this experiment successfully constructed and obtained a strain of Brucella WadC gene with good genetic stability.The deletion strain had similar growth trend with the parent strain under in vitro culture conditions;However,the survival ability of the deletion strain in BMDC cells was significantly weakened.This study laid a foundation for further study on the function of WadC gene of Brucella.     

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。     

牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株的毒力和免疫保护力评价

为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。     

布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究

【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。     

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×10⁸ CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H₂O₂的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×10⁶ CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株（P<0.05;P<0.01）,在H₂O₂条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株（P<0.05）。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株（P<0.01）,但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。     

羊种布鲁氏菌疫苗株PCR-RFLP鉴定方法的建立

为建立一种羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株PCR-RFLP鉴定方法,利用羊种布鲁氏菌Rev.1具有链霉素抗性的特性,选取与链霉素抗性相关编码核糖体蛋白S12的rps L基因为模板设计引物,经PCR扩增后,将产物进行Nci I酶切,发现羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1出现约500 bp条带,而不具有链霉素抗性的羊种布鲁氏菌株16M则出现384 bp条带。结果表明,PCR-RFLP方法能够用于羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株的鉴定,这为今后区分羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1免疫与野株感染提供了基础。     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响

【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同...     

羊种布鲁氏菌的分离鉴定及其ugpB基因的原核表达

对新疆某羊场流产胎儿进行布鲁氏菌病原分离、培养,采用细菌群体形态观察、PCR、生化试验进行鉴定,结果分离得到了羊种布鲁氏菌生物3型,命名为027株.应用常规分子生物学方法克隆羊种布鲁氏菌生物3型027株的ugpB基因,构建原核表达载体pET-ugpB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白UgpB,进行SDS-PAGE和western blot分析,结果表明ugpB融合基因在大肠杆菌中得到了表达;采用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白.     

布鲁菌基因缺失疫苗侯选株研究进展

布鲁菌病是由布鲁菌引起的人兽共患传染病,接种疫苗是预防和控制该病最有效的方法之一。目前国内外使用的疫苗主要是减毒活疫苗,这种活疫苗具有一定的毒力,但不能区分野毒感染与疫苗免疫产生的抗体,会干扰该病的检疫,国内外许多研究者致力于基因缺失标记疫苗。论文综述了近年来布鲁菌基因缺失疫苗株的研究及应用概况,以加深对布鲁菌病新型疫苗的认识。     

猪布鲁菌S2omp10基因缺失株的构建及特性

现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷.本研究利用同源重组的方法,得到了布鲁菌S2株omp10基因缺失株.分别用基因缺失株和疫苗株感染小鼠,比较基因缺失株小鼠体内的存活能力.结果成功构建了布鲁菌S2株omp10基因缺失株,动物试验结果表明,基因缺失株仍能在小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.与原始S2株比较,基因缺失株的感染力进一步减弱.表明omp10基因在布鲁菌的毒力及体内生存方面发挥了作用,为基因标记疫苗的研制奠定了基础.     

布鲁菌疫苗株Rev.1全基因序列的测定与分析

为促进布鲁菌病Rev.1疫苗及相关疫苗的研发, 该研究提取Rev.1疫苗株核酸, 应用PacBio平台进行全基因序列测定与分析。结果表明, Rev.1疫苗株基因组大小约3 299 187 bp, G+C含量为57.2%, 组装为染色体1、染色体2两条环状基因组, 大小分别为2 121 370、1 177 817 bp, G+C含量分别为57.2%、57.3%。将其Ery、BLS和VirB10基因序列与9株GenBank上发表的布鲁菌参考菌株的Ery、BLS和VirB10基因序列进行比较分析, 存在不同程度的差异, 同源性为97.4%~100%。     

牛种布鲁氏菌ClpS基因突变株的构建及其对毒力的影响

试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株2308和突变株ΔClpS两者之间的差异。结果显示,在相同的培养条件下,亲本株2308和突变株ΔClpS的细菌浓度无明显差异,且两者提取的LPS银染结果基本一致,表明ClpS基因突变不影响布鲁氏菌生长速度,不影响细菌LPS合成;在细胞感染模型中,突变株ΔClpS在感染后72 h的胞内存活能力极显著低于亲本株2308（P<0.01）;小鼠感染试验显示,在感染后1周,亲本株2308感染组和突变株ΔClpS感染组小鼠脾脏重量及细菌含量无显著差异,但在感染后4周,突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏细菌含量为10^3.93 CFU/g脾脏,显著低于亲本株2308（10^6.68 CFU/g脾脏,P<0.01）,且突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏肿胀程度极显著低于亲本株2308（P<0.01）。综上所述,布鲁氏菌ClpS基因突变不影响细菌生长速度及细菌LPS合成能力,但ClpS基因突变可降低布鲁氏菌在小鼠脾脏内的定殖能力。     

Construction of Brucella ClpS Gene Mutant Strain and Its Effect on Virulence

The present study aimed to determine the role of ClpS gene,and to analyse the impact of ClpS mutation on the virulence of Brucella.A ClpS gene mutant strain,named ΔClpS was constructed by homologous recombination technology.The bacterial growth kinetics,the LPS synthesis ability and the survival ability of bacterial within macrophages as well as the virulence in mouse model were measured.In addition,the difference between parent strain 2308 and the mutant strain ΔClpS were compared.The results showed that under the same culture conditions,no difference in bacterial concentration was observed between 2308 and ΔClpS strains.The silver staining examination showed that the expression level of LPS extracted from two strains were similar,indicating ClpS gene mutation did not alter the growth rate and LPS synthesis ability of Brucella. In the cell infection assay,the survival ability of ΔClpS strain in cells was extremely significantly lower than that of 2308 strain at 72 h after infection (P<0.01).The results of mouse infection experiment showed that in the first week after infection,no significant difference in spleen weight and bacterial concentration between 2308 and ΔClpS strains infected mice was observed.However,at 4 weeks after infection,the bacterial concentration in spleen of ΔClpS infected mice was 10^3.93 CFU/g spleen,which was significantly lower than that of 2308 strain (10^6.68 CFU/g spleen,P<0.01).The spleen weight of ΔClpS infected mice was also remarkably lower than that of 2308 strain (P<0.01).In summary,the results suggested that the ClpS gene of Brucella did not play a role in Brucella growth rate and ability of LPS synthesis,whereas ClpS gene mutation decreased the ability of Brucella colonization in mouse spleen.