Construction and Identification of Lentiviral Overexpression Plasmid of Mouse Zbtb38 Gene

This study was conducted to construct zinc finger and BTB domain containing 38 (Zbtb38) gene lentiviral overexpression plasmid vector.Firstly,the CDS sequence of mouse Zbtb38 gene was amplified by overlap extension PCR method using mouse spinal cord tissue,and the Zbtb38 CDS sequence front amplification primer 1 and the latter amplification primer 2 were designed respectively.Using the amplification products of the above two primers as template,primer 3 was designed and subjected to fusion PCR amplification,thereby obtaining the full CDS sequence of Zbtb38.Then,the obtained Zbtb38 gene CDS full sequence was ligated to the plasmid pGM-T,and the recombinant plasmid was transferred into E.coli DH5α competent cells,the positive clones were identified and verified by direct PCR and sequencing.Finally,the Zbtb38 CDS sequence was ligated into the lentiviral vector Plvx-puro by XhoⅠ and BamHⅠ double digestion to obtain the shuttle plasmid Plvx-puro-Zbtb38,which was co-transfected with lentiviral packaging plasmids to produce lentiviral particles in 293T cells.The results showed that the primer 1 amplification product contained the first 1-1 794 bp of the Zbtb38 CDS sequence,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 772 bp.The primer 2 amplification product contained the 1 762-3 594 bp of the entire sequence of Zbtb38 CDS,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 818 bp,indicating that the fragmented amplification target fragment was successfully obtained.The expected fusion products amplified by primer 3 and the PCR amplification products of the colonies both contained the complete sequence of Zbtb38 CDS (3 594 bp),which was compared with the CDS sequence of Zbtb38 gene in NCBI database,and the coincidence rate was 99.99%,indicating that the Zbtb38 CDS sequence was successfully amplified.The Real-time PCR results showed that the virus titer reached 3.25×10⁸ Tu/mL,which met the experimental animal injection standard requirement,indicating that the lentiviral vector was successfully constructed.In summary,the mouse Zbtb38 gene lentiviral overexpression plasmid vector was successfully constructed in this experiment.     

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：...     

小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...     

猪瘟病毒E2基因与报告基因lacZ双表达质粒的构建及体外表达

利用反转录和套式PCR技术，从猪瘟病毒(CSFV)石门血毒中扩增出了E2基因，将其用N0tⅠ和XhoⅠ双酶切后，与同样处理的真核表达载体pBudCE4．1相连，获得了pBudCE Es2-22的阳性质粒。对后者再以HindⅢ和XbaⅠ双酶切，并与来自质粒pBudCE lacZ／CAT的lacZ基因片段连接，获得了含CSFV E2基因与lacZ报告基因的真核双表达质粒pBudCE lacZ／Es2—22。该质粒转染BHK21细胞后，用β-Gal Staining试剂盒原位染色可见许多着染蓝色的细胞；用CSFV Antigen试剂盒检测转染细胞的上清液和细胞沉淀，均可检测到含CSFV E2抗原。结果表明，构建的真核质粒pBudCE lacZ／Es2—22实现了2个外源基因的共表达。     

含LacZ报告基因的传染性喉气管炎病毒TK基因转移载体质粒的构建

在传染性喉气管炎病毒北京Ｅ２株ＴＫ基因克隆,鉴定的基础上,进一步构建转移载体质粒,为ＩＬＴＶ ＴＫ基因缺失毒株的构建作准备,先用ＰｓｔＩ将ｐＳＶ－ｇａｌ线性化,再经ＥｃｏＲｉ不完全酶切,分离含ＳＶ４０立即早期启动子和增强子的４．２Ｋｂ的ＬａｃＺ报告基因片段,并用Ｋｌｅｎｏｗ大片段补平,将克隆ＴＫ基因的载体ｐＴＫ用ＳｎａＢＩ处理,后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将以上两个片段平端连续成重组质粒,转化 ＪＭ１０９     

口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1—2A、3C蛋白酶基因和3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入pGEM-T载体。然后，将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle—CMV。构建成功的2个重组穿梭质粒经测序鉴定，含有完整的目的基因表达盒。穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组，以产生重组腺病毒载体。     

猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定

【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质...     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

日本脑炎病毒增殖特性及病毒E基因测序和原核表达质粒构建

设计了一对针对日本脑炎病毒E基因的引物进行RT-PCR扩增,获得了预期大小的目的片段;用扩增产物与pMD18-T Vector进行连接、测序和序列同源性分析;并成功构建了用于原核表达的E基因表达载体pETE,为获得E蛋白并建立ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证

myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。     

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础。慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平。     

鸡痘病毒282E_4株TK基因重组载体质粒的构建

应用已克隆的鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ＿４株基因组ＴＫ基因，在ＮｃｏⅠ部位引入痘苗病毒Ｐ７．５启动子和Ｐ１１启动子控制下的大肠杆菌ＬａｃＺ基因，经酶切鉴定，成功地构建了用于ＦＰＶ重组的载体质粒。与亲本毒株在鸡胚成纤维细胞内共转染，产生了表达ＬａｃＺ基因的重组鸡痘病毒。经传代筛选、纯化，重组病毒较稳定。实验结果表明，以ＴＫ基因构建的重组载体质粒可用于外源基因的重组表达研究。     

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。     

山羊Myostatin基因打靶载体的构建

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4kb、4.5kb.将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%.对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M .     

捻转血矛线虫Hc38保守结构域所在基因片段的真核表达载体构建

根据捻转血矛线虫Hc38基因产物(登录号AY749124)保守结构域所在核酸序列设计1对引物,该引物包含Kozak序列、HindⅢ酶切位点、Xba Ⅰ酶切位点.以含有捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域片段的pMD19-T为模板,经PCR扩增获得Hc38基因保守结构域片段,用HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切该片段,回收后将此基因片段克隆至相同酶切回收后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcD-NA3.1-Hc38.经酶切分析、序列测定和PCR鉴定,证实了重组质粒的正确性.     

小肠结肠耶氏菌毒性质粒基因文库的构建

本研究以pAT153质粒为载体,构建了小肠结肠耶氏菌毒性质粒(pVYE)经限制性内切酶Bam HI和PstI消化产生的DNA片段的基因文库.实验克隆了8株(pYBI～8)pVYE的BamHI片段和6株(pYPI～6)pVYE的PstI片段的重组子.其中pYB4、pYB7、pYB8重组质粒中插入的pVYE—Bam HIDNA片段的分子量分别为8.7、3.8、20kb;pYP3、pYP5、pYP6重组质粒中插入的pVYE-Pst I DNA片段的分子量分别为4.5、3.0、7.0kb.本实验结果为进一步筛选和制备特异性基因探针奠定了基础.     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。