原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

猪流行性腹泻病毒变异株XP2018的分离及S基因序列分析

本研究旨在从临床仔猪腹泻样品中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),并对其S基因进行测序分析.对腹泻仔猪小肠样品进行RT-PCR检测、病毒的分离培养、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定、S基因测序及遗传演化分析.结果显示:仔猪腹泻由流行性腹泻病毒引起;在Vero细胞上成功分离流行性腹泻病毒,命名为XP2018,该毒株细胞病变明...     

山羊小肠上皮细胞的培养及其对氨基酸的代谢利用研究

本试验采用组织块培养法获得原代小肠上皮细胞,联合刮除法、相差消化法纯化原代细胞,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代,对山羊小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定,同时以山羊小肠上皮细胞为模型,体外研究山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢作用。免疫组化鉴定结果表明所分离纯化的细胞为小肠上皮细胞;组氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸是小肠上皮细胞快速利用的氨基酸,在72h内快速下降;天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸是生成的氨基酸,在72h内有所积累;其它氨基酸呈现平缓的被消耗状态。     

体外培养猪小肠上皮细胞大豆凝集素结合位点的标记

本研究旨在获得体外培养状态下的猪小肠上皮细胞,研究猪小肠上皮细胞与大豆凝集素的结合情况.选取新生未哺乳健康仔猪,取小肠组织对小肠上皮细胞进行分离培养,并进行纯化.纯化后的细胞以角蛋白抗体-8为—抗进行细胞免疫化学试验鉴定,鉴定后的猪小肠上皮细胞以FITC-SBA为探针进行细胞凝集素荧光标记化学试验,对猪小肠上皮细胞大豆凝集素结合位点进行标记.结果表明:试验分离纯化的细胞经角蛋白抗体-8鉴定为阳性,所分离纯化的细胞为猪小肠上皮细胞,经检测其纯度达90％以上,猪小肠上皮细胞FITC-SBA标记结果为阳性.体外培养的猪小肠上皮细胞表面存在大量的大豆凝集素结合位点,进一步明确了猪小肠上皮细胞是大豆凝集素结合的主要细胞类型之一,为单胃动物大豆凝集索抗营养机制研究提供理论依据.     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

本研究目的在于建立一种简易可行、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑皮质微血管内皮细胞的方法,为进一步研究其功能打好基础。新生SD大鼠,分离大脑皮质,经匀浆、两步过滤法获得大鼠脑微血管段,用胶原酶消化后,在37℃、5%CO2培养箱中进行原代细胞培养。通过差速消化和差速贴壁方法并结合倒置显微镜下形态学的观察进行传代和纯化,利用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法对培养的细胞进行鉴定。结果显示:成功分离培养了大鼠脑微血管内皮细胞,倒置显微镜下单个细胞呈多角形,互相融合后呈"铺路石"样,单层贴壁生长;免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性。说明本研究建立的大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法,程序简单,获得的细胞纯度较高。     

猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞，筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果：消化法分离的细胞约1周长成单层，组织块贴壁法约2周长满单层，但活力更高；PRCs主要形态为长梭形和大理石样，呈现为2种形态细胞混合生长；差速消化法纯化细胞后，经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞；细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上，本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基，该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变，为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。     

鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法,本研究分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化,筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法,并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示,取鸡输卵管漏斗部,0.25%胰酶+0.02%EDTA联合消化15min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,在20%FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好。培养的细胞在24h时成团贴壁,48~60h明显增殖,呈圆形或多角形"铺路石样"的单层细胞生长,72h后细胞增殖速度减慢,可以维持至10d以上,且传代后细胞贴壁生长良好,经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞,为研究鸭源鸡杆菌对鸡输卵管细胞的侵袭特性提供了良好的体外研究模型。     

肉用杂交犊牛小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

本试验旨在建立肉用杂交犊牛小肠上皮细胞分离培养和鉴定的方法,为研究犊牛小肠上皮细胞营养吸收、免疫调控及肠道屏障功能提供原代细胞培养模型。选用新生未吮乳的肉用杂交犊牛的空肠组织,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法对小肠上皮细胞进行分离,应用相差消化法和相差贴壁法对犊牛小肠上皮细胞进行纯化。通过细胞形态学观察、生长曲线、免疫荧光及染色体核型分析等方法来鉴定细胞。结果表明:1)应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法得到的犊牛小肠上皮细胞生长状况良好,经纯化后得到90%以上纯度的犊牛小肠上皮细胞,并稳定传代至10代以上; 2)犊牛小肠上皮细胞的生长曲线为"S"形,符合细胞增殖规律; 3)免疫荧光鉴定犊牛小肠上皮细胞特异性表达角蛋白13和绒毛蛋白; 4)透射电镜观察发现犊牛小肠上皮细胞边缘有微绒毛结构,细胞与细胞之间的紧密连接结构清晰可见; 5)染色体核型分析显示细胞内含有60条染色体,形态正常,呈二倍体核型。综上所述,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化及相差贴壁纯化成功得到犊牛小肠上皮细胞,为研究犊牛小肠上皮细胞营养物质吸收、免疫调控和肠道屏障功能提供了细胞素材。     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定.结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞.用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠EEC为阳性,即为小肠上皮细胞.     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定。结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞。用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠IEC为阳性,即为小肠上皮细胞。     

Culture of Piglet Intestinal Epithelial Cells in vitro and the Infectivity of Porcine Epidemic Diarrhea Virus on the Cells

The study was aimed to establish a simple in vitro culture system for piglet small intestinal epithelial cells,and to provide materials for researches on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).In this study,newborn piglets that did not eat colostrum were used as the initial donors,and the primary cells were separated in vitro by scraping the intestinal mucosa from the intestinal lumen and mechanical separation and dispersion.The piglet intestinal epithelial cells were purified using 0.1% trypsin differential digestion method.Compared the effects of newborn weak piglets and normal piglets as donors on the activity of primary intestinal epithelial cells.MTT method was used to compare the proliferation activity of primary cells of different generations.Immunofluorescence and Real-time RT-PCR were used to detect the infection and proliferation of PEDV strain CV777 in primary intestinal epithelial cells.The results showed that the isolation and culture method in vitro used in this study could obtain primary intestinal epithelial cells with good proliferation activity,with obvious S-type cell proliferation curves.The cells with high purity and single morphology could be obtained by differential digestion,and had good proliferation activity after five consecutive passages.The proliferative activity of intestinal epithelial cells isolated from weak piglets and normal piglets had no obvious difference,and provided new way for reducing the cost of primary cell culture.The results of immunofluorescence and Real-time RT-PCR showed that PEDV could infect the primary intestinal epithelial cells,and replicated and proliferated in them.In this study,we established a simple,practical and low-cost method for in vitro culture of piglet primary small intestinal epithelial cells.The primary cells cultured by this method could be used as basic materials for the isolation and culture of PEDV and related research.     

原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养方法的改进

目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术，建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法，因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节，国内外所使用方法主要是酶消化法、组织块贴壁法和组织块消化贴壁法。本文旨对先前的方法进行改良，建立一种简便易行、培养周期短、细胞活性及形态良好的原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术。采用健康未孕奶牛子宫为试验材料，取下子宫内膜组织，加入5 mL含2%双抗、40%胰酶的DMEM/F12培养基，4 ℃消化12 h，再将组织移至25 cm²细胞培养瓶中贴壁培养。获得原代细胞后，应用角蛋白-18抗体对细胞进行免疫组化荧光鉴定，并对第3代细胞采用CCK-8法测定不同时间点的D_{450 nm}值，绘制细胞生长曲线。结果显示，培养至第8天，原代细胞基本铺满细胞培养瓶瓶底，有效地缩短了常规组织块贴壁法的周期。通过角蛋白-18免疫组化荧光鉴定，原代上皮细胞的阳性率可达98%以上，相比常规组织块贴壁法来说，纯度明显提高，省去了细胞纯化的操作步骤。细胞增殖状态，符合正常的分裂生长特性。试验结果表明将常规组织块贴壁法进行了优化改良，不仅缩短了培养周期，同时提高纯度，保持细胞活性，为原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术的改良提供一定的参考。     

Effects of epidermal growth factor on atrophic enteritis in piglets induced by experimental porcine epidemic diarrhoea virus

Epidermal growth factor (EGF) promotes gastrointestinal mucosal recovery by stimulating the mitogenic activity of intestinal crypt epithelial cells. The aim of this study was to determine the effects of EGF on atrophic enteritis induced in piglets by experimental infection with porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) strain Dr13. Two groups of 12 conventional, colostrum-deprived, 1-day-old, large White-Duroc cross breed piglets were inoculated orally with PEDV (3 x 10(5) 50% tissue culture infective doses), with or without EGF (10 microg/kg/day, intraperitoneally once daily for 4 days after infection) and compared to 12 uninfected, untreated control piglets. PEDV+EGF piglets had less severe clinical signs than PEDV only piglets at 48 and 60 h post-infection (hpi). Histologically, the ratio of villous height:crypt depth of PEDV+EGF piglets was significantly higher than PEDV only piglets at 36 and 48 hpi. Immunohistochemistry for Ki67 demonstrated increased proliferation in intestinal crypt epithelial cells of PEDV+EGF piglets compared to PEDV only piglets at 36, 48 and 60 hpi. EGF stimulates proliferation of intestinal crypt epithelial cells and promotes recovery from atrophic enteritis in PEDV-infected piglets.     

表皮生长因子对绵羊子宫内膜上皮原代细胞增殖的影响

通过建立和完善绵羊子宫内膜上皮原代细胞体外培养技术,为研究绵羊母体和孕体之间的相互作用机制建立体外着床模型。采用组织块法分离培养子宫内膜上皮细胞,观察其生长情况,并比较不同表皮生长因子（EGF）浓度对子宫内膜上皮细胞增殖的作用效果。结果显示,组织块培养1~2 d后,组织周围迁出子宫内膜上皮细胞,长满60 mm培养皿需9~12 d;经差时消化法纯化后,F1代绵羊子宫内膜上皮细胞纯度可达90%以上,表明所获细胞可用于后续试验;F2代细胞在不同浓度EGF（0、12.5、25、50、75、100 ng/mL）下培养144、168 h,经检测在144 h,12.5、25和100 ng/mL浓度下D_{450 nm}值极显著高于对照组（P<0.01）,50 ng/mL浓度下显著高于对照组（P<0.05）,在168 h,12.5 ng/mL浓度下显著高于对照组（P<0.05）,因此,在12.5 ng/mL EGF作用下效果最佳;F3代细胞在0、12.5 ng/mL浓度下培养不同时间（24、48、72、96、120、144、168、192、216 h）,经检测D_{450 nm}值在144 h差异显著（P<0.05）,168 h后差异极显著（P<0.01）。因此,在培养液中添加12.5 ng/mL EGF可以更加高效、快速得到子宫内膜上皮细胞。     

兔原始生殖细胞体外培养的研究

旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D 4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次,利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining,AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast,REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+2 ng·mL^-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）+4 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）+10 ng·mL^-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF））所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色; RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。     

Research Progress on Primary Culture,Purification and Identification Technique of Bovine Mammary Epithelial Cells

The bovine mammary epithelial cells not only have the function of synthesis and secretion of milk, but also play an important role in innate immunity system of the mammary gland, and there is great significance of them on studying the mechanism of lactation, mastitis pathogenesis and drug screening.Primary cultured bovine mammary gland epithelial cells are suitable for setting up cell model which can be used as the dielectric for physiological, pathological and pharmacological researching, avoiding the difficulties of in vivo test, such as the long cycle, the high cost, the individual difference, etc.The author summarized the latest researches of cell primary culture in vitro, cultivation technology, purification and identification method in order to provide reference for the studies of bovine mammary epithelial cells culture.     

奶牛乳腺上皮细胞原代培养、纯化及鉴定技术研究进展

奶牛乳腺上皮细胞不仅具有合成和分泌乳汁的功能,而且在乳腺的先天免疫中扮演着重要角色,对泌乳机制、乳房炎发病机制的研究,以及药物筛选具有重要意义。原代培养的奶牛乳腺上皮细胞适宜建立细胞模型,可作为生理、病理、药理等方面研究的良好介质,解决体内试验周期长、成本高、个体差异大的难题。作者主要从奶牛乳腺上皮细胞原代培养的发展历程、培养技术、纯化技术及鉴定方法等方面的最新研究情况进行综述,以期为奶牛乳腺上皮细胞培养相关研究提供参考。     

过量赖氨酸对断奶仔猪及其肠道上皮细胞的影响

旨在从体内与体外探究过量赖氨酸对断奶仔猪的影响。本试验选用144头杜×长×大三元杂交断奶仔猪,随机分为4组,每组6个重复,每个重复6头仔猪（3头阉公猪和3头母猪）,各组在日粮中分别添加1.3%、2.6%、3.9%和5.2%的回肠标准可消化赖氨酸（standardized ileal digestibility lysine,SID Lys）,观察其对于仔猪生长性能、器官指数以及生理生化等指标的影响。以IPEC-J2为体外模型,根据培养基与营养需要中氨基酸的种类与比例,添加赖氨酸及其他氨基酸,测定IPEC-J2细胞的增殖情况,并试图通过平衡氨基酸手段降低因过量添加赖氨酸造成的不利影响。结果显示,随着日粮SID Lys添加量的增加,断奶仔猪的生长性能显著下降（P<0.05）,血浆平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）、部分血清游离氨基酸含量和肠道形态受到影响。当在培养基中添加2.0 mmol·L^-1赖氨酸时,IPEC-J2细胞活力显著下降（P<0.05）,培养基中原赖氨酸浓度（0.5 mmol·L^-1）是IPEC-J2生长的最适浓度。当按照培养基中氨基酸平衡比例补充其他必需氨基酸时,细胞活力有一定程度的改善;当按照猪碱性氨基酸的最适比例补充相应浓度的精氨酸与组氨酸时,细胞活力随处理时间的变化而变化。综上所述,单独添加过多的赖氨酸对断奶仔猪的生长会产生负面作用,在生产实际应用中应充分考虑氨基酸之间的平衡。     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SQLE）基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降（P<0.05）,细胞增殖受到极显著抑制（P<0.01）;G1期细胞数量显著下降（P<0.05）,G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升（P<0.05）;肿瘤坏死因子超家族成员6（又称Fas或CD5）的相对表达量显著上升（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27）相对表达量显著上升（P<0.05）,而细胞周期素D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤因子2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax）显著下降（P<0.05）。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。