SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2（establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2）基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组（5~6月龄）、幼年组（1~2岁）和成年组（3~4岁）,每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因（GenBank登录号：MW198470） CDS区为1 833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织（P<0.05）;在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛（P<0.05）;IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。     

KLF2对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响

旨在克隆山羊KLF2基因的锌指结构域序列,明确其在组织及细胞表达模式,最终阐明其对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能发挥作用的方式。本研究以5只1周岁左右的健康简州大耳羊为试验动物,利用RT-PCR、细胞培养、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）、RNA干扰等方法克隆KLF2基因锌指结构,明确KLF2基因的时空表达特性并阐明其对肌内前体脂肪细胞分化的影响。结果显示,本研究获得的山羊KLF2锌指结构域为454 bp（KU041748.1）,且该结构域与绵羊、牛、小鼠的同源性为100%。KLF2在山羊各组织中存在广泛表达,且在肺和腹间脂肪中存在较高水平表达（P<0.05）。KLF2在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达呈先下降又上升然后又下降趋势,且在成脂诱导分化12 h呈最低表达水平,显著低于在未分化的前体脂肪细胞中的表达水平（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰KLF2基因可明显促进山羊肌内脂肪细胞的脂滴积聚;并且PPARγ和C/EBPβ表达量伴随着这个过程分别极显著上调48.5%（P<0.01）和显著上调43.6%（P<0.05）;同时该家族中的KLF1、KLF13、KLF14、KLF15和KLF16表达水平极显著升高（P<0.01）,KLF4显著下降（P<0.05）,KLF3、KLF6、KLF8、KLF9及KLF11极显著下降（P<0.01）。山羊KLF2的锌指结构域与其他物种同源性高度保守,且其在山羊肺和腹间脂肪中表达量较高（P<0.05）。同时KLF2是山羊肌内脂肪细胞分化的负调控因子,并且可能通过PPARγ和C/EBPβ基因来发挥作用,且与其他KLFs基因存在等级调控现象。     

PLCγ1基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响

旨在探究磷脂酶Cγ1（phospholipase Cgamma 1,PLCγ1）基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响,为揭示PLCγ1基因在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。本研究选取包裹3层以上颗粒细胞的绵羊卵母细胞为试验材料,体外培养成熟后将其分为两组,利用显微注射技术将PLCγ1基因导入MⅡ期（减数第二次分裂中期）卵母细胞（n=127）中为试验组,以显微注射空载体pcDNA3.1-EGFP作为对照组（n=120）,经48 h后统计其卵裂率;并利用Ca²⁺探针Rhod 2-AM监测MⅡ卵母细胞和显微注射后16、48、72、96、120 h时各时期卵母细胞以及早期胚胎内Ca²⁺波动。结果显示,PLCγ1基因显微注射后卵母细胞被激活,卵裂率为（（19.67±0.2）%,P<0.01）,桑椹胚发育率为（（9.00±0.17）%,P<0.05）;PLCγ1基因注射后,卵母细胞和早期胚胎不同发育时期有Ca²⁺浓度变化,可观察发现Ca²⁺主要分布在胞质中且注射48 h时可达到峰值（P<0.01）。结果表明,PLCγ1基因可以引起绵羊卵母细胞发育过程中发生Ca²⁺振荡,启动其卵裂,并促使早期胚胎的继续发育。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛（P<0.01）;此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛（P<0.05,P<0.01）,而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著（P>0.05）。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

水禽StAR基因克隆、表达及其对睾丸发育的影响

旨在获取水禽StAR基因的结构和组织表达规律，初步了解其对水禽睾丸发育的影响。本研究选取山麻鸭和狮头鹅的下丘脑和睾丸组织为材料，克隆StAR基因，并采用实时荧光定量PCR方法检测该基因在山麻鸭和狮头鹅不同组织中的表达规律，并进一步比较该基因在不同时期鹅睾丸组织中的表达差异。本试验克隆获得鸭StAR基因3个转录本（dSTAR-A、dSTAR-B和dSTAR-C），dSTAR-A和dSTAR-B编码序列相同，编码283个氨基酸，而dSTAR-C编码238个氨基酸；获得鹅STAR基因两个转录本（gSTAR-A和gSTAR-B），均编码283个氨基酸。比对分析发现，鸭和鹅StAR氨基酸序列与其他禽类的同源性较高，在物种间的保守性高。StAR基因在鸭和鹅的各个组织中均有表达，其中在睾丸中表达量最高，在腹脂、胸肌和腿肌也有较高的表达水平。比较不同时期公鹅的睾丸，发现该基因在3岁龄时表达水平极显著高于1和52日龄（P<0.01），且在成年公鹅繁殖期的表达水平极显著高于休产期（P<0.01）。结果表明，StAR基因可能是鹅睾丸发育所必需的关键基因，并参与成年公鹅繁殖性能的调控。     

日粮添加不同水平芦丁对热应激小鼠睾丸组织的影响

本试验旨在探讨日粮添加不同水平芦丁对缓解热应激小鼠睾丸组织损伤的影响。将30只5周龄体重相近（20～22 g）的ICR系雄性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别饲喂基础日粮添加0（CON组）、0（HS组）、250（HS+R250）、500（HS+R500）和1 000（HS+R1000） mg·kg^-1芦丁的日粮,饲养10 d后,除对照组（CON）外,所有小鼠在每天10：00至14：00之间置于42℃恒温箱中连续处理8 d后屠宰取样分析。结果显示：1）与CON组相比,HS组小鼠睾丸指数无显著变化（P>0.05）,而日粮添加250 mg·kg^-1芦丁显著提高热应激小鼠睾丸指数（P<0.05）;小鼠睾丸组织切片结果显示,与CON组相比,HS组小鼠生精小管直径和横截面积显著降低（P<0.05）,生精细胞脱落比率显著增加（P<0.05）;与HS组相比,HS+R250组小鼠生精小管横截面积显著增加（P<0.05）,生精细胞脱落比率显著降低（P<0.05）,HS+R500组生精细胞脱落比率也显著降低（P<0.05）,HS+R1000组小鼠生精小管直径显著增加（P<0.05）;小鼠睾丸指数、生精小管直径及生精小管脱落比率在芦丁处理组与CON组之间无显著差异（P>0.05）,但HS+R250组小鼠睾丸生精小管横截面积显著高于CON组（P<0.05）。2）与CON组相比,HS组小鼠睾丸组织丙二醛（MDA）含量显著升高（P<0.05）,总抗氧化能力（T-AOC）与还原型谷胱甘肽（GSH）含量以及血红素酶-1（HO-1） mRNA的表达量均显著降低（P<0.05）;日粮添加250 mg·kg^-1芦丁显著降低热应激小鼠睾丸组织中MDA含量（P<0.05）,提高T-AOC与GSH含量（P<0.05）,并增强核因子E2相关因子2（Nrf2）、HO-1和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） mRNA的表达量（P<0.05）,而添加500和1 000 mg·kg^-1芦丁也显著提高了GSH含量（P<0.05）;与CON组相比,除HS+R250组Nrf2 mRNA表达量显著高于CON组（P<0.05）外,芦丁组热应激小鼠睾丸组织抗氧化相应基因与酶活指标均无显著性变化（P>0.05）。3）热应激小鼠睾丸中核因子-κB （NF-κB）、TOLL样受体4（TLR-4）和Bax的mRNA表达量显著增加（P<0.05）,而Bcl-2表达量显著降低（P<0.05）;日粮添加250 mg·kg^-1芦丁显著降低NF-κB、TLR-4、髓样分化因子88（MyD88）、白细胞介素-Iβ（IL-1β）和Bax mRNA表达量（P<0.05）,增强Bcl-2的表达水平（P<0.05）;添加500 mg·kg^-1芦丁显著降低NF-κB和TLR-4表达量（P<0.05）,而1 000 mg·kg^-1芦丁能够显著增加Bcl-2的表达（P<0.05）;小鼠睾丸组织中免疫和增值凋亡相关基因的表达量在添加芦丁组及CON组之间无显著性差异（P>0.05）。结果提示,日粮添加适宜剂量芦丁具有改善热应激小鼠睾丸组织形态及功能的效果,其机制可能与芦丁通过Nrf2信号通路缓解氧化应激,通过TLR-4/NF-κB信号通路抑制炎症反应及调控Bax/Bcl-2 mRNA的表达密切相关。本试验条件下日粮添加250 mg·kg^-1芦丁的效果较好。     

母猪妊娠期不同能量水平对后代公猪生长性能、睾丸发育与免疫的影响

试验旨在研究母猪妊娠期能量水平对后代睾丸发育与免疫的影响及其作用机理。选取30头体重、背膘相近的7~9胎长白×约克夏（LY）经产母猪,按照体重和胎次随机分为2组,每组15个重复,每个重复1头母猪,从妊娠当天分别饲喂正常能量（CON）和低能量饲粮（LE,12.55 MJ/kg）,直到分娩,所有母猪哺乳期均饲喂同一饲粮。分娩后,分别从CON和LE组中挑选体重为平均体重±0.05 kg的后代公猪各15头,断奶后所有公猪按阶段饲喂相同饲粮,于仔猪120日龄时结束试验。记录公猪每个月的体重并计算阶段平均日增重和平均日采食量;采集28和120 d的血液进行血清生化指标和免疫相关细胞因子检测,采集28和120 d的睾丸进行睾丸细胞计数和睾丸免疫相关基因检测。结果表明,与对照组相比,LE组0~59 d平均日增重极显著降低（P<0.01）,28~89 d平均日采食量和0 d睾丸重显著降低（P<0.05）,28 d睾丸指数显著增加（P<0.05）;LE组0和120 d睾丸组织内间质细胞数目、120 d生殖细胞数目、28和120 d支持细胞数目均显著降低（P<0.05）;LE组血清中28 d甘油三酯（TG）和120 d睾酮（T）含量均极显著升高（P<0.01）、雌二醇（E₂）含量极显著降低（P<0.01）,TG、T和E₂含量均存在时间和能量的交互作用（P<0.01）;LE组血液中胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量120 d时极显著降低（P<0.01）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、TC、HDL-C三者均无时间和能量的交互作用（P>0.05）。随着公猪日龄增加,血液中白细胞介素-1α（IL-1α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、免疫球蛋白（IgG）浓度均极显著增加（P<0.01）,其中TNF-α和IL-1β有能量和时间的交互作用。与对照组相比,LE组28 d时TNF-α含量显著降低（P<0.05）,120 d时IL-1β水平显著升高（P<0.05）。LE组28 d紧密连接蛋白1（ZO1）及0和28 d闭合蛋白（Occludin）基因相对表达量均显著降低（P<0.05）,28和120 d时连接黏附分子1（JAM1）基因相对表达量显著增加（P<0.05）。LE组0 d时CCL4基因和28 d时IL-1α基因相对表达量均显著降低（P<0.05）,0和120 d时趋化因子2（CCL2）基因及28 d时细胞间黏附分子1（ICAM1）和酪氨酸激酶2（JAK2）基因相对表达量均显著增加（P<0.05）。与对照组相比,28 d时Toll样受体1（TLR1）基因、0 d时肿瘤坏死因子受体超家族成员Ⅰ型（TNFRSF1A）基因相对表达量均显著降低（P<0.05）,0 d时B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子（NFKBIA）、IL-1β和干扰素（IFNG）基因相对表达量均显著增加（P<0.05）。综上所述,母猪妊娠期摄入12.55 MJ/kg能量水平饲粮可降低后代公猪日增重、平均日采食量和睾丸重;降低后代公猪睾丸内生殖细胞数量及免疫相关细胞因子和睾丸免疫相关基因的表达,从而对后代成年后的免疫能力和繁殖性能产生深远影响。     

Cloning of L-PGDS Gene and Its Expression Pattern in Different Tissues and Testis at Different Development Stages in Cattle-yak

The purpose of this study was to clone the prostaglandin D synthase (L-PGDS) gene and identify its expression pattern in various tissues and testis at different development stages in cattle-yak,in order to provide experimental basis for studying the mechanism of L-PGDS gene in testis development of cattle-yak.The total RNA of heart,liver,spleen,lung,kidney,large intestine,small intestine,gastric,brain and testis at different development stages (fetal,calve tuberty and old) of healthy cattle-yak were extracted by Trizol method.The L-PGDS gene sequence was amplified and cloned by RT-PCR,and analyzed by related biological software.The expression of L-PGDS gene mRNA in different tissues and testicular tissues at different development period of in cattle-yak were detected by Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of L-PGDS gene was 624 bp,including the ORF of 576 bp,which encoded 191 amino acids.Homology alignment results showed that L-PGDS gene in cattle-yak had high homology with Bos taurus and Ovis aries,which were 99.28% and 94.00%,respectively.Phylogenetic tree results showed that the relation between cattle-yak and Bos taurus was the closest,followed by Ovis aries and Equus caballus.The L-PGDS protein was an unstable hydrophobic protein,the molecular weight was 21.229 ku,the molecular formula was C₉₅₃H₁₄₇₁N₂₅₁O₂₈₁S₉,the isoelectric point was 6.43,and the instability index was 47.25.The L-PGDS protein had no transmembrane region and no signal peptide.The secondary structure of L-PGDS protein contained alpha helix,random coil and extended chain,the rats of them were 25.65%,53.40% and 20.94%,respectively.L-PGDS gene was highly expressed in testis of cattle-yak,which was extremely significantly higher than that in other tissues (P<0.01).The expression of L-PGDS gene mRNA in testis of cattle-yak increased firstly and then decreased along with age,and with the highest expression in puberty stage,which was extremely significantly higher than that at other periods (P<0.01).This study provided basic data for further study on the mechanism of L-PGDS gene in the development of testis in cattle-yak.     

绵羊CREBRF基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对绵羊Luman/CREB3募集因子(CREBRF)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在绵羊不同组织中的表达量,为探究CREBRF基因在绵羊中的生物学功能提供理论参考。【方法】 以绵羊卵巢cDNA为模板,通过PCR扩增和克隆绵羊CREBRF基因完整CDS区序列,并进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测CREBRF基因在绵羊不同组织中的表达水平。【结果】 绵羊CREBRF基因CDS区序列全长1 920 bp,编码639个氨基酸。相似性比对结果表明,绵羊CREBRF氨基酸序列与山羊、牛、人、小鼠、猪、犬、马、鸡、鸭和斑马鱼的相似性分别为99.8%、99.1%、95.4%、93.6%、98.3%、97.5%、98.4%、88.0%、87.5%和61.3%。系统进化树分析结果显示,绵羊与山羊、牛的亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。生物信息学分析发现,绵羊CREBRF蛋白分子式为C₃₁₂₆ H₄₉₁₄ N₈₅₈ O₁₀₅₆ S₂₁,分子质量为72.08 ku,等电点(pI)为4.77,半衰期为30 h,肽链N-端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为54.83;CREBRF蛋白存在于细胞核内,不具备跨膜性,无信号肽,为亲水性不稳定蛋白。CREBRF蛋白二级结构主要以无规则卷曲(47.57%)为主,其次为α-螺旋(37.09%)。实时荧光定量PCR结果显示,CREBRF基因在绵羊不同组织中均有表达,其中在心脏、肾脏和卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】 本试验获得了绵羊CREBRF基因CDS区全长序列,并初步研究了其组织表达规律,为研究绵羊胚胎发育的调控机制及提高繁殖力等提供了材料。     

山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1cDNA序列克隆及表达

试验旨在克隆山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列,探究其表达的组织特异性及其在小肠中的表达发育模式。参考GenBank已发表的绵羊、牛SLC3A1基因mRNA序列设计引物,克隆山羊SLC3A1基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR的方法分析其在1日龄山羊11种组织及其在1日龄、6月龄、8月龄、10月龄、12月龄山羊十二指肠、空肠、回肠中的mRNA表达情况。结果表明,成功克隆得到了山羊SLC3A1基因cDNA序列,其与绵羊、牛、野猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为99%、97%、88%、86%、80%和79%。SLC3A1基因转录表达有明显的组织特异性,其在1日龄山羊肾脏、回肠、空肠、结肠中表达量依次降低(P<0.05),其他组织中表达量很低。同一月龄山羊,SLC3A1基因在不同肠段的表达量数值上回肠>空肠>十二指肠。SLC3A1基因在不同月龄山羊十二指肠表达量以1日龄山羊为最高(P<0.05),6~12月龄山羊相同肠段之间表达量无显著差异(P>0.05);空肠表达量随山羊年龄的增加均呈现逐步降低的趋势;回肠表达量在各个月龄山羊之间差异不显著(P>0.05)。结果说明,山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1的主要表达部位在肾脏和肠道,推测b^0,+碱性氨基酸转运系统转运氨基酸的主要部位为肾脏和肠道。SLC3A1基因在山羊小肠受肠段和发育阶段的影响,具有不同的表达发育模式。     

Cloning and Expression of Caprine Cationic Amino Acid Transporter Gene SLC3A1 cDNA Sequence

The objective of this study was to clone caprine cationic amino acid transporter gene SLC3A1 and investigate its mRNA expression in different tissues and its development regularity in small intestine.The cDNA sequence of caprine SLC3A1 gene was cloned with the primer which was designed according to mRNA sequence of Ovis aries and Bos taurus in GenBank.Then its expression was quantified by Real-time PCR in 11 tissues from goats at the age of day 1 and duodenum,jejunum and ileum from goats at the age of day 1,month 6,month 8,month 10 and month 12.The results indicated that cDNA sequence of SLC3A1 gene was obtained,and its homology with SLC3A1 gene in Ovis aries,Bos taurus,Sus scrofa,Homo sapiens,Mus musculus and Rattus norvegicus were 99%,97%,88%,86%,80%,79%,respectively.SLC3A1 gene was expressed in all of these collected tissues,whereas the expression level varied from tissues.Specifically,its expression in kidney,jejunum,ileum and colon were significant higher than that in other tissues at the age of day 1 and decreased systematically (P<0.05).The expression of SLC3A1 in small intestine at the same age of goat was ileum>jejunum>duodenum.SLC3A1 gene expression in duodenum at the age of day 1 was significant higher than that at the other ages (P<0.05),it decreased with age in jejunum,and there was no significant difference among ileum with age (P>0.05). In conclusion,SLC3A1 gene and b^0,+ cationic amino acid transporter system were mainly expressed in kidney and intestine.The expression of SLC3A1 gene was differentially regulated and distributed by developmental stages and segments of small intestine in goat.     

藏山羊SFRS18基因克隆、表达及其与肌内脂肪含量相关性研究

试验旨在克隆藏山羊SFRS18(splicing factor arginine/serine-rich 18)基因CDS序列,并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达特征以及与肌内脂肪含量进行相关性分析,为深入研究该基因在山羊肌内脂肪沉积中的作用积累数据。采用RT-PCR技术获得藏山羊SFRS18基因序列,结合生物信息学分析蛋白的理化性质、结构和不同物种的同源性,实时荧光定量检测SFRS18 mRNA表达情况,并将表达量与肌内脂肪含量相关联。结果表明,藏山羊SFRS18基因cDNA序列长为1299 bp,开放阅读框(ORF)长为1272 bp,编码423个氨基酸,蛋白分子结构式为C₂₀₀₃H₃₄₂₄N₇₆₀O₆₉₆S₄,分子质量为49.42 ku,等电点pI=11.20,SFRS18蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽;有103个磷酸化位点,2个N-糖基化位点和39个O-糖基化位点;亚细胞定位于在细胞核(82.6%)、细胞质(8.7%)、细胞骨架(4.3%)和质膜(4.3%),属于非跨膜蛋白;预测二级结构由0.71% α-螺旋和99.29%无规则卷曲组成;藏山羊核苷酸序列和氨基酸序列与牛、绵羊和水牛的相似性最高(99%),系统进化树分析表明藏山羊与牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,SFRS18基因在藏山羊的不同组织中都存在表达,其中在脾脏中表达水平最高,在背最长肌中表达水平最低;在藏山羊背最长肌和腿肌中SFRS18 mRNA表达与肌内脂肪含量均呈显著正相关(r=0.081,P<0.05;r=0.373,P<0.05)。SFRS18基因可以作为调节山羊脂肪沉积的候选基因。     

藏羊MSTN基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】对藏羊肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)基因进行克隆和生物信息学分析,检测其在藏羊不同组织中的表达,为探究MSTN基因在藏羊中的生物学功能提供参考。【方法】以藏羊背最长肌组织cDNA为模板,克隆藏羊MSTN基因完整CDS区序列并测序,用SeqMan程序对测序结果进行拼接,并用BLAST在线程序对组装后的序列进行分析鉴定。用生物信息学软件进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析,用实时荧光定量PCR检测MSTN基因在藏羊不同组织中的表达量。【结果】藏羊MSTN基因CDS全长为1 128 bp,编码375个氨基酸。藏羊MSTN基因氨基酸序列与绵羊、牦牛、牛、猪、恒河猴、人、黑猩猩、犬、鸡及斑马的相似性依次为100.0%、93.4%、93.4%、95.2%、94.4%、94.2%、94.4%、93.1%、87.8%和87.5%;系统进化树分析结果表明,藏羊与绵羊的亲缘关系最近,与斑马和鸡的亲缘关系最远。藏羊MSTN蛋白属于亲水性分泌蛋白,且具有不稳定性,不含跨膜结构,含1个信号肽,存在31个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化修饰位点,主要分布在线粒体和细胞质中;MS...     

猪SKP1基因的克隆及其在梅山猪与杜洛克猪卵泡中的表达研究

为探索SKP1(S-phase kinase association protein 1)基因在猪卵泡中的表达规律,本试验从猪卵泡组织中克隆了猪SKP1基因CDS区全长序列,采用Real-time PCR方法检测SKP1基因在不同组织中的表达谱,进一步分析了该基因在梅山猪和杜洛克猪S卵泡、M1卵泡、M2卵泡、L卵泡中的表达。结果表明,经克隆测序,得到了猪SKP1基因492 bp编码区全长序列,与羊、人、黑猩猩、牛、大鼠的同源性分别为93.10%、92.90%、92.29%、91.89%、89.86%。SKP1基因在各组织中均有不同程度的表达(肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、子宫角、垂体、黄体、大脑、下丘脑),其中在子宫、脾脏、输卵管中表达量较高。SKP1基因的表达量在梅山猪S卵泡、M1卵泡和M2卵泡中的表达量均高于杜洛克猪,特别是在梅山猪M1卵泡和M2卵泡中SKP1基因的表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),分别达到了2.39、2.82倍,而在L卵泡中的表达量却是杜洛克猪高于梅山猪,结果提示SKP1基因可能参与猪卵泡发育过程。     

Cloning of Porcine SKP1 Gene and it's Expression Studies between Meishan and Duroc Pigs with Follicle

To detect the expression pattern of S-phase kinase association protein 1 (SKP1) gene in during porcine follicle development.The coding sequence (CDS) of SKP1 gene was cloned from porcine follicular tissue.To analyze the tissue expression profiling of SKP1 gene and its expression level in follicles with different diameter (S,M1,M2,L) from Duroc and Meishan pigs were investigated by Real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that the length of CDS of porcine SKP1 was 492 bp,and it's similarity with that of Ovis aries,Homo sapiens,Pan troglodytes,Bos taurus and Rattus were 93.10%,92.90%,92.29%,91.89% and 89.86%,respectively.SKP1 mRNA was expressed in all tested tissues (muscle,fat,heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovarian,tubal,uterine,uterine horn,pituitary,corpus luteum,brain,hypothalamus),and especially high in uterine,spleen and tubal.Both in Meishan pig.The expression of SKP1 mRNA in S,M1 and M2 follicles were higher than Duroc pig.Especially,the expression in Meishan pig M1 and M2 follicles were significantly higher than Duroc pig (P<0.01),respectively 2.39,2.82 times,and the expression of L follicle in Duroc pig was higher than Meishan pig,which suggested that SKP1 gene might be involved in the process of procine's follicular development.     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

水牛HSD17B1基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛17β-羟类固醇脱氢酶1 (17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1,HSD17B1)基因对水牛繁殖性能的影响,本试验采用了3'-RACE克隆获得HSD17B1基因,并对其核苷酸序列和蛋白质序列进行了生物信息学分析,通过构建其真核表达载体并转染293T细胞验证所构建载体的准确性。结果表明,水牛HSD17B1基因编码区长954 bp,3'-UTR区长58 bp,编码317个氨基酸。BLAST分析显示水牛HSD17B1核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、犬、非洲象和人的相似性分别为100%、100%、92%、94%、87%、87%和87%,系统进化树分析结果表明,HSD17B1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。蛋白质分析结果表明HSD17B1蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚定位于细胞质,存在type1_17beta-HSD-like_SDR_c、PRK05993、LPOR和FabG等结构域。试验成功构建了水牛HSD17B1基因真核表达载体pEGFPN1-HSD17B1,转染293T后,产生较强的绿色荧光信号,表明能够形成HSD17B1-EGFP融合蛋白。水牛HSD17B1基因的克隆及其真核表达载体的成功构建,为今后阐明HSD17B1基因在水牛卵泡及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。