Discovery,Isolation,Identification and Characterization of Novel Non-ribosomal Peptide Antibacterial Active Substances in Bacillus

The aim of this study was to search for novel non-ribosomal peptide antimicrobial substances based on the screening of bacterial secondary metabolites.The bacteria isolated from soil,sea water and common marine organisms in Yantai coastal area were isolated and purified.E.coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 29213 were selected as indicator bacteria,and E.coli B2 (bla_NDM-5+mcr-1) and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) T144 were used as indicator for secondary screening.The genome was extracted and the PCR products were sequenced to determine the active species.The secondary metabolites of bacteria were extracted by organic extraction,purified by gel chromatography and preparative liquid chromatography,and purity was detected by analytical liquid chromatography.The results of sequencing showed that the active strain belonged to Bacillus amyloliquefaciens sp.,and was named as Bacillus amyloliquefaciens 9-14 (active bacterium 9-14).The results of antibacterial test showed that the metabolites of active bacterium 9-14 had high inhibitory effect on Staphylococcus aureus ATCC 29213,MRSA T144,E.coli ATCC 25922 and E.coli B2.The metabolites of active bacterium 9-14 were cyclic lipopeptides composed of amino acid chains,which belonged to the derivatives of ibuprofen.The biological characteristics and antibacterial spectrum of the metabolites of active bacterium 9-14 were studied.The results showed that the metabolites of active bacterium 9-14 had good thermal stability and acid-base stability.And the antibacterial activity of the antibacterial substance treated with trypsin,pepsin,protease K and papain was not significantly weakened and had good stability.The antibacterial substance also had inhibitory effect on Staphylococcus aureus and E.coli,but had no activity against Pseudomonas aeruginosa,Klebsiella pneumoniae,Enterococcus faecalis and Bacillus cereus.In this study,a new antibacterial substance was obtained,which could be used as the precursor of antibacterial drugs,and could provide certain reference for food safety and disease control.     

芽孢杆菌非核糖体肽的研究进展

芽孢杆菌产生的非核糖体肽主要有脂肽、多肽、线状聚酰胺物等类型,其生物合成是通过“硫模板多聚酶机制(th iotemp late mu ltienzym e m echan ism)”的多功能酶复合系统进行的,并经甲基化、酰基化、糖基化、杂环化和环化等进一步修饰而成。特殊的生物合成机制决定了非核糖体肽具有氨基酸组成及分子形式复杂、分子量较小、理化性质稳定、生物活性多样等特点,同时表现出了对病原微生物不同的抑、杀菌机制。非核糖体肽作为人类丰富的新型抗菌药物资源,在植物病害的生物防治、人类和动物疾病的治疗等方面显示了诱人的前景。研究芽孢杆菌及其产生的非核糖体肽在蚕业上的应用,有利于绿色、生态蚕业的发展。     

猪源芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

从自然生长的健康猪肠道中分离到13株芽孢杆菌,通过生理生化试验初步鉴定其中9株为枯草芽孢杆菌,2株为巨大芽孢杆菌,1株为地衣芽孢杆菌,1株为凝结芽孢杆菌;对这13株芽孢杆菌分别进行了耐酸性试验、耐胆盐试验、体外抑菌试验和动物安全性试验。结果表明,其中1株地衣芽孢杆菌B7株和1株枯草芽孢杆菌B9株均有较强的耐酸、耐胆盐能力,对致病性大肠杆菌具有较好的体外抑制能力,且均安全无毒,可作为动物用益生菌制剂的候选菌种。     

仔猪鲍曼不动杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为鉴定陕西某规模化场猪场发酵床养殖圈舍仔猪发生严重腹泻症的病原,本研究对病死仔猪肝、脾等脏器进行细菌分离,对疑似致病菌进行生化试验鉴定和16S rDNA测序,并进行小鼠接种试验验证细菌毒力和药敏实验检测敏感药物.结果显示分离菌为鲍曼不动杆菌(Ab),对小鼠具有较强的致病性,对卡那霉素等少数抗生素敏感,对其它多种抗生素具有耐药性.本研究结果表明Ab对仔猪具有较大威胁,特别是对发酵床养殖模式下的仔猪具有更大威胁.     

牛源抗氧化芽孢杆菌的分离鉴定及生物特性研究

【目的】从奶牛瘤胃中分离具有抗氧化能力且耐受性好的芽孢杆菌,为牛源益生菌作为抗氧化添加剂使用提供理论依据及参考。【方法】采集3头成年荷斯坦奶牛瘤胃内容物,通过细菌分离纯化、形态观察、生化检测及16S rDNA分子检测进行鉴定,同时检测筛选菌株的超氧自由基和羟自由基清除率、耐酸、耐胆盐能力及对抗生素的耐药性。【结果】从奶牛瘤胃液中共获得了12株菌,通过特异性培养基与革兰氏染色共筛选出5株芽孢杆菌(X-1～X-5)。对5株芽孢杆菌进行分子鉴定,确定X-1为热噬淀粉芽孢杆菌,X-2为短小芽孢杆菌,X-3为解蛋白芽孢杆菌,X-4为枯草芽孢杆菌,X-5为沙福芽孢杆菌。抗氧化能力检测结果显示,5株菌均具有一定的抗氧化能力,X-5菌株抗氧化能力最高,超氧自由基和羟自由基清除率分别达到73.81%和73.54%。当pH为2.5时,5株芽孢杆菌存活率均在25%以上;胆盐浓度为0.6%时,5株芽孢杆菌存活率均在60%以上,说明菌株具有良好的耐受性。药敏试验结果显示,试验分离出来的大多数菌株对氧氟沙星、呋喃妥因、红霉素等高度敏感;对头孢呋辛、头孢噻肟、链霉素等耐受;对卡那霉素、环丙沙星、氨苄西林等中度敏感。...     

黑山羊醋酸钙不动杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为确诊南宁某养殖户黑山羊死亡的病因,取病死黑山羊的肝、脾和心血进行了细菌分离培养。通过形态学鉴定、生化试验、16S r DNA测序分析、小鼠攻毒试验、药敏试验和耐药基因检测等方法,对分离到的疑似致病菌进行鉴定及药敏特性观察。结果显示,分离菌为醋酸钙不动杆菌,可引起80%的小鼠死亡(4/5),表明该分离菌株对小鼠有较强的致病性。药敏特性发现该菌对青霉素类、头孢菌素类、呋喃类等4种抗生素耐药,对磺胺类、氯霉素类及多粘菌素类等5种抗生素呈中敏;对喹诺酮类、氨基糖苷类及大环内酯类等9种抗生素敏感。检出磺胺类、四环素类及氯霉素类等的14个耐药基因。结果表明,分离的醋酸钙不动杆菌毒力较强,有多重耐药性,对养殖业有一定的危害,要引起重视。     

一株芽孢杆菌的分离鉴定及相关特性的初步研究

为了获得适应当地环境的益生菌株,从当地土壤中分离得到一株芽孢杆菌,经鉴定为蜡样芽孢杆菌.经安全性试验及抗逆性试验,研究了其在不同pH值、不同温度下的生长情况,并进行了药敏试验.结果表明,该菌无毒性,具有抗逆性,最适pH值为6～8,最适宜温度为37℃,可作为益生菌进行微生态制剂方面的进一步研究.     

白僵菌菌株的分离鉴定及生物学特性研究

以9株白僵菌菌株为材料,对其进行鉴定并探讨了菌株的生物学特性。结果表明,有2株为卵孢白僵菌,7株为球孢白僵菌;以营养生长量、产孢量、抗紫外线能力和致病力等生物学指标进行综合比较筛选,球孢白僵菌B1为生产白僵蚕的最佳接种菌株。     

广西猪丹毒杆菌分离鉴定及生物学特性研究

试验收集2013年6月至2014年2月广西南宁、桂林、柳州、玉林、贵港、钦州等6个市送检的疑似猪丹毒发病的材料,用鲜血琼脂平板对病料进行细菌分离,37℃恒温箱培养24~48 h,观察分离细菌的菌落形态,并进行革兰氏染色观察,初步确定其为革兰氏阳性的细小杆菌。为进一步确定分离出的是否为猪丹毒杆菌,试验进一步纯化细菌,提取细菌DNA用16S rRNA随机引物进行扩增,将扩增出来的目的片段连接到p MD18-T载体上,进行克隆、酶切鉴定及序列测定;最终将测序获得16S rRNA序列在NCBI上进行BLAST,结果表明试验最终分离出5株猪丹毒杆菌,为进一步确定分离出来猪丹毒杆菌的生物学特性,试验做了进一步深入研究：药物敏感性试验、小白鼠攻毒试验、耐药基因的检测、免疫攻毒保护性试验。     

鸡轮状病毒的分离鉴定及特性研究

用胰蛋白酶处理发病鸡的粪便和肠内容物，接种Marcl45细胞．盲传数代后．从山东不同地区发生流行性腹泻的鸡群中分离到1株病毒，并对分离病毒的生物学特性和理化特性进行了部分研究。结果表明病毒粒子呈轮状、大小为70～80nm；其病毒基因组的电泳图谱为5：1：3：2；病毒的TCID50为10^-4-19／0．1mL，能被轮状病毒阳性血清所中和；病毒对氯仿、乙醚有抵抗力；对pH3．0处理60min稳定；50℃ 30min能使其感染力下降10^2；1mol／L MgCl2不能增强其对50℃ 60min的抵抗力。接种2周龄SPF鸡．24h后陆续发病，表现为持续性水样腹泻；剖检可见病鸡脱水、小肠内有大量的液体和气泡、肠黏膜变薄；组织学变化表现为肠绒毛坏死、脱落．绒毛平均长度减少而隐窝深度增加，固有层中淋巴细胞浸润。其临床症状及病理组织学变化与自然发病相同。因此确定发生在山东鸡流行性腹泻的病原为A群轮状病毒，该研究为轮状病毒感染的防制提供了理论依据。     

用树脂法分离提取类芽孢杆菌(Paenibacillus)Cp-S316抗细菌活性物质

类芽孢杆菌Cp-S316对家蚕真菌、细菌病原物具有广谱抗性。为研究抗菌物质的化学结构、理化性质,并探讨其工业化生产的可行性,研究了不同树脂对抗细菌活性物质的吸附性能,对吸附性能优良的树脂进行了解吸性能的比较,并对解吸剂进行了筛选。结果:X-5树脂对活性物质具有较好的吸附性能,当树脂与发酵液混合后的质量浓度为0.03 g/mL时,振荡吸附4 h,其吸附率为90%;以0.02 mol/L HCl-75%丙酮为最佳解吸剂,层析柱柱长12 cm,直径1.5 cm,流速3.9 mL/(cm2.min)动态解吸,其总解吸率为92%,其中浓度较高部分(树脂与解吸液混合后的质量浓度为0.67 g/mL)的解吸率为90%。关键词类芽孢杆菌Cp-S316;活性物质;分离提取;树脂     

1株犬副流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72 h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步生长曲线的测定,同时扩增N基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,试验成功从出现咳嗽、流鼻涕等呼吸系统疾病症状的病犬肺脏中分离出1株CPIV,命名为CPIV-BJ01;RT-PCR扩增结果发现,在534 bp处有特异性目的条带。病毒电镜观察发现,其超微结构呈圆形、有囊膜、直径在80～200 nm之间;血凝试验显示,病毒在4和37℃均能凝集1%猪红细胞,与报道的CPIV血凝特性一致;病毒对热敏感,长时间高温下病毒毒价会随之下降;紫外照射可使病毒在短时间内对细胞的感染性急剧下降。病毒一步生长曲线测定结果显示,在12～48 h病毒高速增殖,细胞培养液中病毒滴度急剧上升,之后趋于稳定。CPIV N基因序列与19株有代表性的副流感病毒N基因相比,其核苷酸序列同源性为97.1%～99.8%。遗传进化分析表明,CPIV-BJ01与PIV5 1168-1(登录号:KC237064.1)和PIV5 ZJQ 221(登录号:KX100034.1)位于同一分支上,亲缘关系较近。     

多黏类芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化及特性研究

试验旨在分离纯化多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）BLCC1-0402代谢产物中的抗菌肽,为抗菌肽制备及其制品检测提供参考。采用离心、不同分子质量卷式膜超滤浓缩、Superdex peptide 10/300GL凝胶过滤层析对多黏类芽孢杆菌发酵上清液进行逐级分离纯化,对不同时段的收集液做抑菌试验,以大肠杆菌O78标准菌株为指示菌,采用打孔法进行抑菌活性检测,比较评价分步层析效果,以Tricine-SDS-PAGE进行分子质量检测。结果显示,通过5和3 ku卷式膜超滤获得的3~5 ku组分蛋白质样品抗菌活性较强;对于3~5 ku组分经凝胶过滤层析分离纯化,纯化后的抗菌肽A3抑菌活性最强,经Tricine-SDS-PAGE小分子多肽电泳检测,已达到电泳纯,分子质量为4 ku;抑菌活性检测结果显示,该抗菌肽A3对大肠杆菌O78标准菌株具有较强的抑菌作用。同时,抗菌肽A3表现出较好的耐热性,90~100 ℃处理15 min,抑菌活性可保持在96%左右;具有较好的酸碱稳定性,在pH 2.0~9.0下,抑菌活性保持在90%以上;经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低20%,胰蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低18%,蛋白酶K对抗菌肽A3的抑菌活性几乎无影响。本研究结果表明,分离得到的抗菌肽A3是一种对大肠杆菌O78具有抑菌活性的新型抗菌肽,具有一定的开发潜力,可为下一步抗菌肽的结构分析、理化特性分析等深入研究提供一定参考依据。     

一株乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究

以鸡肠道和泡菜为分离源,采用常规微生物学方法分离乳酸菌,筛选到一株产酸性能良好的菌株W7。结合对菌株的形态观察、生理生化试验以及16S rRNA基因序列分析,对菌株进行鉴定,并对W7进行特性试验研究。结果表明,W7为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,在培养22h时,活菌数最高;耐酸效果好,在pH值为2.0时,存活率仍然为100%;在胆盐浓度为0.30%时,仍然可以生长;抑菌效果较好;黏附率为79.9%。     

黄牛阿氏肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为查明广西某牛场病死黄牛的病死原因,提供科学的综合防治措施,用细菌分离、生化鉴定、细菌16S rRNA测序、体外药敏试验、常见病原的PCR检测等方法对送检的病料进行检测。结果显示,化脓隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、肺炎克雷伯菌、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测结果均为阴性。而从出血肺组织中分离到1株能引起小鼠致死的短杆状革兰阴性菌,该细菌在血琼脂平板上呈灰白色菌落,不溶血;在麦康凯培养基上呈圆形灰色、轻度隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为0.2 mm^0.3 mm的针尖状小菌落;在营养肉汤中生长呈絮状物浑浊。生化鉴定发现其符合阿氏肠杆菌的生化特性,16S rRNA测序结果显示该菌与阿氏肠杆菌的基因序列同源性为99%。体外药敏试验结果显示该菌仅对头孢类药物敏感,头孢类药物作用效果强度为头孢曲松钠>头孢地嗪钠>头孢哌酮钠舒巴坦钠。     

猪流感病毒的分离与鉴定

从广东某猪场表现发热和流鼻涕等呼吸道症状的猪群采集28份样品,用鸡胚分离到9株病毒。将病毒传代至第6代,经血清学鉴定、理化特性检查、电镜观察、生物学特性检查和人工致病试验,结果表明,4株分离株为H1N1亚型猪流感病毒,5株为H3N2亚型猪流感病毒。     

驴乳房炎大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了查明导致新疆某规模化奶驴场乳房炎的主要病原菌及其生物学特性,试验采用常规微生物学方法对病原菌进行分离,采用生化鉴定管和16S rRNA的PCR扩增方法对病原菌进行鉴定,采用K-B药敏纸片法测定其耐药性,D_{600 nm}值绘制细菌生长曲线,最后分析同源性并构建系统进化树。结果显示,分离株为革兰氏阴性短杆菌,能在麦康凯培养基上长出粉红色菌落,在伊红－美兰培养基上长出有金属光泽的菌落;生化鉴定分离株的葡磷胨水、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖试验均呈阳性,而苯丙氨酸和硫化氢试验均为阴性;PCR扩增后测序得到205 bp的1号菌株和203 bp的2号菌株,其特性符合大肠杆菌的特性;药敏结果表明,分离株对链霉素和氯霉素高度敏感,对青霉素、阿莫西林和庆大霉素耐药;生长曲线表明,分离株在2~16 h时为高度繁殖期,16~32 h处于稳定期,32 h以后开始进入衰退期;1号菌株与2号菌株同源性高达99%,1号菌株与大肠杆菌11J和RCB800的同源性最高（100%）;2号菌株与大肠杆菌675SK2和DTU-1的同源性最高（100%）;由系统进化树分析可知,1号菌株与大肠杆菌11J和RCB800处于同一个小分支,2号菌株与大肠杆菌675SK2和DTU-1处于同一个小分支。因此,导致本次驴乳房炎的病原菌为大肠杆菌,本研究结果为进一步系统研究导致驴乳房炎大肠杆菌的致病机制提供参考。