水牛徒手克隆胚胎培养及冷冻条件的优化

本试验利用微滴、微穴和平板培养系统对徒手克隆(hand-made clone,HMC)重组胚进行体外培养;采用了40% EG(ethylene glycol,EG)、25% EG＋25% DMSO(dimethylsulphoxide,DMSO) 和20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为玻璃化冷冻液对HMC囊胚进行了超低温冷冻;并且比较了HMC与传统核移植的胚胎生产效率及囊胚冷冻存活率。结果表明,微穴系统的卵裂率要显著高于平板系统(P<0.05),极显著高于微滴系统(P<0.01);且微穴系统的囊胚率(40.0%)极显著高于平板(19.8%)和微滴系统(8.3%)(P<0.01)。采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为冷冻保护剂时HMC囊胚存活率极显著高于40% EG(P<0.01);HMC重组胚的融合率和囊胚率均高于传统核移植法(P<0.05;P<0.01),而HMC囊胚的冷冻存活率与传统核移植生产的囊胚没有显著差异。以上结果说明水牛HMC可以替代传统核移植法生产克隆胚胎,微穴体系最适合水牛HMC胚胎的体外培养,且采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖对HMC囊胚进行玻璃化冷冻可以取得良好的冷冻效果。     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

猪胚胎早期卵裂时间与其发育潜能关系的初步研究

旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养，将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组（16~22 h）与晚期卵裂组（26~32 h）统计比较卵裂率和囊胚率，并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明，猪孤雌激活胚胎在16~22 h发生卵裂的为50%~60%，而26 h之后发生卵裂的不到20%，在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%，42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组（P<0.05）。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组（P<0.05），Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组（P<0.01），Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组（P<0.01），而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎（26~32 h）显著上调（P<0.05）。结果显示，初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎，其囊胚多能性相关基因表达上调，凋亡相关基因表达下调，卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。     

奶牛活体采卵-体外受精效率的影响因素研究

为建立稳定高效的活体采卵-体外受精技术体系,提高体外胚胎生产效率,本研究先利用屠宰场采集的新鲜卵巢卵母细胞进行体外受精,通过胚胎发育潜力来筛选最佳的体外胚胎培养液;再进一步研究不同种公牛精液和供卵母牛对活体采卵-体外受精效率的影响。结果显示,CR1aa培养液和mCR1aa培养液卵裂率差异不显著（P>0.05）,但mCR1aa组的囊胚发育率显著提高（28.1% vs 20.6%,P<0.05）;选取的3头荷斯坦种公牛精液的活体采卵-体外受精胚胎的卵裂率差异不显著（P>0.05）,但1号种公牛精液体外受精后囊胚率（38.7%）显著高于2号和3号（23.8%&22.9%）（P<0.05）;随机选择的3头活体采卵供体母牛（H1、H2、H3）获得的头均可用卵母细胞数无显著差异,但H1和H2供体母牛体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于H3供体牛（P<0.05）,且H1供体牛体外受精囊胚率显著高于H2供体牛（P<0.05）。结果表明,mCR1aa培养液能显著提高体外受精囊胚发育率,适用于体外胚胎生产;种公牛精液和供体母牛个体差异会直接影响活体采卵-体外受精胚胎的生产效率,为奶牛活体采卵-体外受精生产技术体系的优化提供参考。     

不同培养液及微滴内卵母细胞数等因素对肉牛体外胚胎生产效率的影响

为了探讨不同体外胚胎培养液及微滴内卵母细胞数等因素对肉牛体外胚胎生产效率的影响,以优化其活体采卵-体外胚胎生产(OPU-IVP)技术体系,以屠宰场卵巢为卵母细胞来源,对比了不同培养液的胚胎生产效率;根据微滴(100μL/滴)内卵母细胞数量将培养体系分为5、10、15和20枚/滴四组,探究了卵母细胞数对胚胎发育能力的影响;以OPU为卵母细胞来源,将培养体系分为10枚/滴和≥10枚/滴两组,探索了不同卵母细胞数对胚胎发育能力的影响。结果表明:(1)屠宰场来源卵母细胞,Ⅰ组培养液(BO系列培养液)的成熟率(85.85±1.60)、8～16细胞(67.42±1.47)及囊胚率(37.23±0.99)都显著高于Ⅱ组培养液(P0.05)。(2)屠宰场来源的卵母细胞,微滴内卵母细胞数对卵裂率无显著影响(P0.05),但20枚/滴的8～16细胞率显著高于其它3组(P0.05),其囊胚率显著高于5枚/滴组(P0.05);≥10枚/滴组的8～16细胞率及囊胚率显著高于10枚/滴组(P0.05)。(3)OPU来源卵母细胞,其微滴内卵母细胞数对卵裂率无显著影响(P0.05),但≥10枚/滴组的8～16细胞率及囊胚率显著高于10枚/滴组(P0.05)。使用BO系列培养液,微滴内培养卵母细胞数≥10枚时,能显著提高肉牛OPU-IVP效率。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

藏红花素对小鼠卵母细胞体外成熟能力的影响

试验旨在探讨藏红花素（crocin）的抗氧化应激作用对小鼠卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响。在体外成熟（IVM）培养液中添加不同浓度藏红花素（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L），小鼠卵母细胞在体外成熟培养12 h后，检测卵母细胞第一极排出情况、卵母细胞胞质内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量，并进行体外受精（IVF）；体外受精后6 h统计受精率，24 h统计卵裂率，96 h统计囊胚率。结果显示，与对照组相比，10、15 μmol/L藏红花素显著提高了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；当藏红花素浓度继续增加时，卵母细胞的第一极体排出率下降，30 μmol/L藏红花素显著降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；5、10、15 μmol/L藏红花素均显著降低了卵母细胞ROS含量（P<0.05），10、15 μmol/L藏红花素均显著提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）。与对照组相比，10 μmol/L藏红花素组受精率、卵裂率、囊胚率差异均不显著（P>0.05），15、20、25、30 μmol/L藏红花素均显著降低受精率和囊胚率（P<0.05），对卵裂率影响不显著（P>0.05）。结果表明，在小鼠卵母细胞体外成熟培养液中添加10 μmol/L藏红花素可以显著增加第一极体排出率，显著降低卵母细胞ROS含量、提高卵母细胞GSH含量，但对受精后的胚胎发育无显著影响。     

芝麻素对小鼠早期胚胎体外发育的影响

本试验旨研究在体外培养（in vitro culture，IVC）中添加芝麻素（sesamin，SES）对小鼠早期胚胎体外发育的影响。采集6周龄雌性昆明小鼠受精卵，随机分为对照组和不同浓度（10、50、100 μmol/L）SES组。采用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342免疫荧光染色分别检测囊胚内细胞凋亡率和总细胞数；采用DCFH-DA检测早期胚胎内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用CMF₂HC检测早期胚胎内谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；采用JC-1检测早期胚胎线粒体膜电位强度。结果显示，不同浓度SES组分裂率和囊胚率较对照组均有提高，但无显著差异（P>0.05）；50 μmol/L SES组细胞数较对照组显著提高（P<0.05），细胞凋亡率较对照组显著降低（P<0.05）；与对照组相比，50 μmol/L SES组ROS水平显著降低（P<0.05），GSH水平和线粒体膜电位水平显著提高（P<0.05）。结果表明，在IVC中添加SES可提高囊胚内细胞数、减少细胞凋亡率，降低细胞内ROS水平，提高细胞内GSH水平，改善早期胚胎线粒体功能，减少胚胎氧化应激的损伤，提高小鼠早期胚胎发育质量。     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００～２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ＞０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留卵丘细胞再培养４８ｈ形成的单层细胞，可代替标准方法制作的单层小滴用于体外受精胚胎的共同培养，供胚胎发育培养的单层细胞使用多次不影响囊胚发育率，经简化的ＩＶＦ技术获得的胚胎非手术移入情期同步受体牛子宫角２～２．５个月后直检有５８．３％（７／１２）妊娠。我们认为，传统的牛胚胎体外生产技术经过简化可以提高生产效率，不会减少囊胚发育率和妊娠率，值得推广应用。     

不同共培养体细胞和胎牛血清浓度对牛体外受精后早期胚胎的影响

利用屠宰黄牛的卵母细胞经体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)后的早期胚胎,与单层颗粒细胞(GC)、输卵管上皮细胞(BOEC)等体细胞共培养及在胎牛血清的胚胎培养液中的后续发育进行了研究,并探讨了其影响因素,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:使用GC和BOEC体外共培养牛体外受精后胚胎,均取得了较好的囊胚发育率;且牛体外受精后早期胚胎体外培养体系中,添加10%血清能有效地促进牛体外受精后胚胎的囊胚率。     

Optimization of in vitro Culture System for Embryos Derived from Ovum-pick-up and Zona-free Embryos in Buffalos

The purpose of this study was to explore the problems of low development efficiency of small amounts in vitro fertilization (IVF) embryos and limited development potential of zona pellucida-free embryos when cultured in vitro of mammals,to establish an efficient and stable in vitro production system for improving the developmental potential of living ovum-pick-up (OPU) and handmade clone (HMC) embryos in buffalos.The study first compared the effect of the number of fertilized eggs (1,3,5,10 and 20) co-cultured within a single microdroplet on the embryonic development effect.Then,OPU-IVF embryos were cultured using the well-of-the-well (WOW) system and the auxiliary co-culture system (adding agarosaccharide fragments of embedded in in vitro fertilization (IVF) fertilized egg in the cultivation of microdroplets).Furthermore,the embryos without zona pellucida were cloned and reconstructed by using the WOW system and compared with the traditional microdroplet system in vitro.The results showed that the blastocyst development rates of the 10 and 20 embryos groups were significantly higher than that of the 1,3 and 5 embryos groups.Compared with the microdroplet system,the assisted co-culture system and the WOW system significantly improved the blastocyst rate of OPU-IVF embryos(P<0.01).Moreover,the WOW culture system significantly promoted the cleavage rate and blastocyst rate of HMC reconstructed embryos(P<0.01).To sum up,embryo mass culture contributed to embryo development,and under the premise of ensuring a clear pedigree,the agar-sugar embedding assisted embryo co-culture system and the WOW system improved the in vitro development efficiency of OPU-IVF embryos,the WOW system would also be applied to the high-efficient culture of zona pellucida free embryos.     

高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells, TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA),对扩增成功且DNA量大于1 000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示：1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22....     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5 μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组（P < 0.05）;采用7.5 μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率（83.80%）和囊胚率最高（35.39%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）,而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率（83.98%）和囊胚率最高（55.62%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著（P < 0.05）。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5 μg/mL CB 处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5 μg/mL CB 处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

bFGF对3-硝基丙酸处理的小鼠受精卵体外发育能力的影响

【目的】研究在体外培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对3-硝基丙酸(3-NPA)处理的小鼠受精卵体外发育能力的影响,为提高氧化应激早期胚胎体外发育质量提供参考。【方法】在小鼠受精卵体外培养液中添加0、20、50、100和150 ng/mL bFGF,培养24、48和96 h,统计2-细胞率、4-细胞率和囊胚率,筛选最佳bFGF处理浓度。经腹腔注射12.5 mg/kg 3-NPA生产氧化应激体内受精卵,正常组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,将获得的受精卵分为添加或不添加bFGF组,即3-NPA和3-NPA+bFGF组及对照组(C)和bFGF组,培养到囊胚后,用DCFH-DA检测胚胎内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平,CMF2HC检测谷胱甘肽(glutathione, GSH)水平,JC-1检测早期胚胎线粒体膜电位强度。【结果】0、20、50、100和150 ng/mL bFGF组2-细胞率均无显著差异(P>0.05),100 ng/mL bFGF组囊胚率显著高于其他各组(P<0.05),150 ng/mL bFGF组4-细胞率和囊...     

SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组），牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后，观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况；利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平；采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平；体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精，观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示，体外培养24 h，SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05），而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加，卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）；添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05），而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后，SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05），但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）；INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05），但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后，SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）；卵母细胞体外培养36 h后，INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明，SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟，在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂，有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化，同时改善早期胚胎的发育能力。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

Beneficial Effect of Two Culture Systems with Small Groups of Embryos on the Development and Quality of In Vitro‐Produced Bovine Embryos

Currently, in vitro‐produced embryos derived by ovum pick up (OPU) and in vitro fertilization (IVF) technologies represent approximately one‐third of the embryos worldwide in cattle. Nevertheless, the culture of small groups of embryos from an individual egg donor is an issue that OPU‐IVF laboratories have to face. In this work, we tested whether the development and quality of the preimplantation embryos in vitro cultured in low numbers (five embryos) could be improved by the addition of epidermal growth factor, insulin, transferrin and selenium (EGF‐ITS) or by the WOW system. With this aim, immature oocytes recovered from slaughtered heifers were in vitro matured and in vitro fertilized. Presumptive zygotes were then randomly cultured in four culture conditions: one large group (LG) (50 embryos/500 μl medium) and three smaller groups [five embryos/50 μl medium without (control) or with EGF‐ITS (EGF‐ITS) and five embryos per microwell in the WOW system (WOW)]. Embryos cultured in LG showed a greater ability to develop to blastocyst stage than embryos cultured in smaller groups, while the blastocyst rate of WOW group was significantly higher than in control. The number of cells/blastocyst in LG was higher than control or WOW, whereas the apoptosis rate per blastocyst was lower. On the other hand, the addition of EGF‐ITS significantly improved both parameters compared to the control and resulted in similar embryo quality to LG. In conclusion, the WOW system improved embryo development, while the addition of EGF‐ITS improved the embryo quality when smaller groups of embryos were cultured.