miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞，油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响，qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况，利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示，miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少，过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低（P<0.05），而KLF4表达量极显著升高（P<0.01）；转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高（P<0.01）。荧光素酶活性试验结果显示，过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

KLF2对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响

旨在克隆山羊KLF2基因的锌指结构域序列,明确其在组织及细胞表达模式,最终阐明其对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能发挥作用的方式。本研究以5只1周岁左右的健康简州大耳羊为试验动物,利用RT-PCR、细胞培养、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）、RNA干扰等方法克隆KLF2基因锌指结构,明确KLF2基因的时空表达特性并阐明其对肌内前体脂肪细胞分化的影响。结果显示,本研究获得的山羊KLF2锌指结构域为454 bp（KU041748.1）,且该结构域与绵羊、牛、小鼠的同源性为100%。KLF2在山羊各组织中存在广泛表达,且在肺和腹间脂肪中存在较高水平表达（P<0.05）。KLF2在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达呈先下降又上升然后又下降趋势,且在成脂诱导分化12 h呈最低表达水平,显著低于在未分化的前体脂肪细胞中的表达水平（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰KLF2基因可明显促进山羊肌内脂肪细胞的脂滴积聚;并且PPARγ和C/EBPβ表达量伴随着这个过程分别极显著上调48.5%（P<0.01）和显著上调43.6%（P<0.05）;同时该家族中的KLF1、KLF13、KLF14、KLF15和KLF16表达水平极显著升高（P<0.01）,KLF4显著下降（P<0.05）,KLF3、KLF6、KLF8、KLF9及KLF11极显著下降（P<0.01）。山羊KLF2的锌指结构域与其他物种同源性高度保守,且其在山羊肺和腹间脂肪中表达量较高（P<0.05）。同时KLF2是山羊肌内脂肪细胞分化的负调控因子,并且可能通过PPARγ和C/EBPβ基因来发挥作用,且与其他KLFs基因存在等级调控现象。     

miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化调节作用的研究

旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因；过表达miR-128-1-5p后，用qPCR检测增殖标志基因的表达，CCK-8和EdU检测细胞增殖情况；用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势；通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制；用油红O染色检测成脂能力。结果表明，KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中，过表达miR-128-1-5p后，增殖标志基因的表达量显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），细胞活力显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），新生细胞数显著减少（P<0.05）。前体脂肪细胞分化过程中，miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关；过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量（P<0.01），显著下调了KLF2蛋白的表达量（P<0.05），显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达（P<0.05或P<0.01），产生更多脂滴；抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述，miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖，在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达，促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

民猪脂肪细胞分化过程中抗寒相关基因表达规律研究

旨在探究民猪脂肪细胞分化过程中产热基因和米色脂肪标记基因的表达变化规律，为进一步研究民猪脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制提供依据。本研究采集1月龄民猪的背部脂肪组织，分离前体脂肪细胞进行培养及成脂诱导，观察分化过程中细胞形态并进行油红O染色鉴定；检测产热基因UCP3、PGC-1α、PPARα和米色脂肪标记基因EBF2、CD81、PDGFRα在诱导分化第0、2、4、6、8天的表达量。结果表明，随着诱导分化的时间增加，细胞中的脂滴逐渐增多，在分化第8天时进行油红O染色，多数细胞达到成熟脂肪细胞阶段。以第0天为对照，PGC-1α、EBF2、PDGFRα在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且达到最高，第4、6、8天呈下降趋势。UCP3在第4、6、8天表达量极显著升高（P<0.01），第8天有所下降。PPARα和CD81在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且在第4和6天表达量与第2天相比变化不大。综上表明，本研究成功进行了民猪前体脂肪细胞的成脂诱导分化，揭示了分化过程中产热和米色脂肪标记基因的表达规律，为进一步研究民猪前体脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制和民猪抗寒能力奠定基础。     

秦川牛ACTC1基因的表达特性分析

试验旨在揭示ACTC1基因在秦川牛中的时空表达规律，为进一步研究ACTC1基因在肉牛肌肉发育和脂肪沉积等方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR技术检测了ACTC1基因在24月龄成年秦川牛13种组织和4日龄新生秦川牛12种组织中的表达规律，同时研究分析了该基因在秦川牛成肌细胞和前体脂肪细胞不同分化阶段（0、2、4、6、8 d）的表达特性。结果显示，ACTC1基因在秦川牛心脏中的表达量最高，骨骼肌中次之；除瘤胃和肾脏外，24月龄成年牛各组织中的表达量显著或极显著高于4日龄新生牛（P<0.05；P<0.01）；ACTC1基因在成肌细胞中的表达随着分化程度的增加呈现先升高后降低的趋势，在成肌细胞分化第2、4、6和8天ACTC1基因的表达量与第0天相比差异极显著（P<0.01），分别是第0天的2.6、4.7、5.6和4.2倍，这与成肌细胞的分化速率一致；在脂肪细胞中ACTC1基因的表达趋势为先降后升，第2、4天的表达量与第0天相比差异极显著（P<0.01），从分化第2天开始表达量随脂肪细胞分化程度增加而增加。ACTC1基因在不同年龄牛肌肉组织（心肌和骨骼肌）中的表达量最高，且其表达特性与肌细胞分化整体趋势一致；另外，ACTC1基因在脂肪细胞中的表达也有一定的规律。综上所述，推测ACTC1基因可能会影响牛肌肉组织的生长发育和脂肪沉积。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

ADCY2基因表达对延边黄牛脂肪前体细胞成脂分化的影响

本试验旨在研究环腺苷酸（3',5'-cyclic adenosine monophosphote,cAMP）环化酶合成酶2（adenylyl cyclase 2,ADCY2）基因对延边黄牛脂肪前体细胞成脂分化的影响。选取3日龄的延边黄牛腹股沟皮下脂肪组织进行脂肪前体细胞的分离、培养和诱导分化;设计ADCY2基因的干扰片段（siADCY2-1、2、3）,构建pEX4过表达载体;分别收集正常诱导（对照组）、干扰和过表达0、5和10 d的脂肪细胞。用实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖激活物受体（PPARγ）、CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）和ADCY2在细胞分化过程中mRNA的转录水平,并用Western blotting法检测其蛋白的表达;用油红O染色检测脂滴含量的变化;用甘油三酯试剂盒检测甘油三酯含量。试验结果表明,在成脂分化过程中,与未分化相比,ADCY2基因在分化的第5和10天表达量均极显著上升（P<0.01）,而分化第10天与第5天相比水平极显著下降（P<0.01）;siADCY2-1干扰效率最高,过表达ADCY2基因使其mRNA水平升高;与对照组相比,过表达组细胞内ADCY2基因mRNA水平提高了约4 000 000倍,脂肪细胞内脂滴含量和甘油三酯的含量极显著提高（P<0.01）,成脂关键基因C/EBPα和PPARγ表达极显著上调（P<0.01）,而RNA干扰组细胞内ADCY2基因mRNA水平极显著降低（P<0.01）,脂肪细胞内脂滴含量和甘油三酯的含量极显著下降,成脂关键基因C/EBPα和PPARγ表达极显著下调（P<0.01）。因此,ADCY2基因过表达能显著增加成熟脂肪细胞的脂滴含量及甘油三酯含量,促进成脂关键基因C/EBPα和PPARγ的表达,说明ADCY2基因对脂肪细胞分化具有正向调控作用。     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

籽鹅和莱茵鹅MSTN和MyoG基因表达及其与屠宰性状的相关分析

本研究旨在探讨肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)和肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因对鹅骨骼肌生长发育的影响。试验以莱茵鹅和籽鹅为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定MSTN、MyoG基因在籽鹅和莱茵鹅胸肌、腿肌中的差异表达情况,运用统计软件对基因表达情况与屠宰性状间的相关性进行分析。结果显示,莱茵鹅胸肌重和胸肌率极显著高于籽鹅(P<0.01),籽鹅胸肌MSTN、MyoG mRNA表达量极显著高于莱茵鹅(P<0.01);在腿肌中,籽鹅MSTN mRNA表达量极显著低于莱茵鹅(P<0.01),籽鹅与莱茵鹅MyoG mRNA表达量间无显著差异(P>0.05)。同一品种MSTN mRNA表达水平也存在差异,在籽鹅胸肌和腿肌中表达量存在极显著差异(P<0.01);在莱茵鹅胸肌和腿肌中表达量存在显著差异(P<0.05)。就MyoG mRNA而言,在籽鹅和莱茵鹅胸肌和腿肌中表达量存在极显著差异(P<0.01)。MSTN基因表达与屠宰性能相关性分析表明,胸肌中MSTN mRNA表达量与活重、胸肌重和胸肌率呈极显著负相关(P<0.01);胸肌和腿肌中MyoG mRNA表达量与活重呈极显著正相关(P<0.01)。说明MSTN和MyoG基因可能对肌肉生长分别起正负调控作用。     

猪lncRNA TCONS_00791383对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为了探究lncRNA TCONS_00791383对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织（心、脾、肺、肾、背肌和腿肌）以及猪骨骼肌卫星细胞增殖分化前后TCONS_00791383的表达水平；通过设计反义核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）片段在猪骨骼肌卫星细胞中对TCONS_00791383进行敲低，检测敲低TCONS_00791383之后增殖分化标志基因的表达量变化；通过trans （co-expression）对TCONS_00791383进行靶基因预测，使用DAVID对其进行GO富集和KEGG通路分析。结果显示，TCONS_00791383在猪心脏中表达量最高，在脾和肾组织中不表达。在骨骼肌卫星细胞从增殖到分化的过程中，TCONS_00791383的表达量逐渐上升，且在分化后30 h表达量达到最高。在使用ASO片段敲低TCONS_00791383之后，与对照组相比，在分化24 h，增殖标志基因Pax3、Pax7表达量显著或极显著降低（P<0.05，P<0.01），分化标志基因MyoG表达量极显著降低（P<0.01），在分化48 h，增殖标志基因Pax3表达量极显著降低（P<0.01），Pax7表达量显著降低（P<0.05），分化标志基因MyHC表达量显著降低（P<0.05）。预测得到的相关靶基因富集到AMPK、ATP等多个与骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程相关的重要信号通路。本研究表明，lncRNA TCONS_00791383可能促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。     

Mechanism of C-type Natriuretic Peptide Regulating Lipid Deposition of Intramuscular Adipocytes in Chickens

The aim of this study was to investigate the regulatory effect and mechanism of C-type natriuretic peptide (CNP) on the proliferation,differentiation and lipolysis of intramuscular preadipocytes (IMPs) in breast muscle of chickens,and lay a foundation on further elucidating the molecular mechanism of intramuscular fat deposition in chickens.The IMPs of breast muscle in Yellow-feathered broilers were used as the model in vitro,the preadipocytes were induced by 10^-7 mol/L CNP.The proliferation,differentiation and lipolysis of IMPs were observed by CCK8,Edu staining,Oil Red O staining and isopropanol extraction,respectively.The concentration of cGMP and glycerin were detected by cGMP and glycerin kit,respectively.The expression of NPRA,NPRB and NPRC genes mRNA was detected by Real-time quantitative PCR.The results showed that compared with control group,the cell proliferation in CNP treatment group was enhanced significantly at 1 and 3 d (P<0.05).The cell differentiation and lipid deposition were extremely significantly decreased at 3 and 6 d (P<0.01),the intracellular cGMP concentration and glycerin concentration in the medium at 3 and 6 d were extremely significantly increased (P<0.01).The expression of NPRB and NPRC genes mRNA in CNP treatment group was extremely significantly or significantly higher than control group (P<0.01;P<0.05),and the expression of NPRA gene mRNA had no significant difference (P>0.05).The results revealed that CNP regulated the lipid deposition of intramuscular adipocytes through NPRB/NPRC-cGMP pathway in chickens.     

Kruppel样因子15对和盈黑鸡前体脂肪细胞增殖分化的影响

旨在明确和盈黑鸡Kruppel样因子15(KLF15)的组织、细胞表达模式,阐明干扰KLF15对和盈黑鸡前体脂肪细胞增殖分化的影响。本研究采用RT-qPCR技术检测KLF15在各组织中表达分布、在腹脂组织的发育性表达规律以及在成脂诱导分化不同时期细胞中的表达水平;干扰KLF15后,采用CCK-8和EdU法检测细胞增殖,利用油红O染色、甘油三酯含量分析以及脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPa和FAS)的检测,分别从细胞形态学和分子生物学等角度明确干扰KLF15对和盈黑鸡前体脂肪细胞成脂分化的影响。研究结果表明,KLF15在和盈黑鸡各组织中存在广泛表达,在肝、腿肌和腹脂组织中表达量较高;KLF15在公、母鸡腹脂中分别呈“L”和“U”型表达趋势,表达高峰均出现在1日龄;KLF15 mRNA在细胞分化前期缓慢升高,表达高峰出现在细胞分化后期;细胞增殖检测发现,CCK-8和EdU结果趋势一致,干扰KLF15极显著抑制了前体脂肪细胞的增殖(P＜0.01);明显减少了前体脂肪细胞的脂滴积聚,极显著降低了甘油三酯含量(P＜0.01),且脂肪细胞分化标志基因PPARγ和C/EBPa mRNA水平极显著下调(P＜0.01),FAS mRNA水平显著下调(P＜0.05)。本研究揭示了和盈黑鸡KLF15的表达模式,验证了干扰KLF15能够抑制前体脂肪细胞的增殖分化,推测KLF15是前体脂肪细胞的负调控因子,可能是通过调控PPARγ、C/EBPa和FAS等分化关键基因的表达来实现的。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。     

miR-17-3p Regulates Preadipocyte Differentiation by Targeting KCTD15 in Yanbian Yellow Cattle

The aim of this study was to explore whether miR-17-3p could target KCTD15 to regulate the preadipocytes differentiation of Yanbian Yellow cattle. Bioinformatics softwares were used to identify homology and predict target genes of miR-17-3p. miR-17-3p mimic or miR-17-3p inhibitor and their negative control were transfected into bovine preadipocytes to overexpress or inhibit the expression of miR-17-3p. The binding sites of miR-17-3p to KCTD15 were verified via double luciferase report system. qRT-PCR and Western blot were used to detect the effect of miR-17-3p on the expressions of PPARγ, C/EBPα and KCTD15 both at mRNA and protein levels. Bioinformatics software prediction showed that KCTD15 was the target gene of miR-17-3p, and miR-17-3p had high homology in mammals. The mRNA and protein expressions of adipogenic marker genes PPARγ and C/EBPα after transfection of miR-17-3p mimic were significantly or extremely significantly higher than those of the control group transfected with NC-mimic (P<0.05 or P<0.01). After the expression of miR-17-3p was inhibited, the expressions of PPARγ and C/EBPα were significantly or extremely significantly lower than that in the control group (P<0.05 or P<0.01). Through the dual-luciferase reporter assay verification, the overexpression of miR-17-3p extremely significantly inhibited the fluorescent activity of the luciferase reporter gene vector containing the 3'UTR fragment of KCTD15 (P<0.01). Overexpression of miR-17-3p could also significantly or extremely significantly inhibit the expression of KCTD15 mRNA and protein(P<0.05 or P<0.01). However, inhibition of miR-17-3p expression could significantly increase the expression of KCTD15 mRNA and protein(P<0.05). These results suggest that miR-17-3p may regulate the differentiation of preadipocytes in Yanbian Yellow cattle by inhibiting the expression of KCTD15.     

NR1H3基因调控猪前体脂肪细胞分化的研究

旨在探讨NR1H3基因在猪脂肪组织中的发育性表达规律及对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响,以确定其在脂肪沉积过程中的主要功能。本研究采用qRT-PCR方法检测30、90、240日龄马身猪皮下脂肪组织中NR1H3的发育性表达规律;采集5日龄杜长大仔猪背部脂肪组织,分离猪前体脂肪细胞;通过细胞免疫荧光技术检测细胞中Adiponectin含量以鉴定细胞的纯度;构建猪NR1H3基因的过表达载体,设计NR1H3 siRNA序列,分别转染分离得到的猪前体脂肪细胞,采用qRT-PCR、Western blot和油红O染色等方法检测过表达和干扰效率及它们对成脂分化关键基因表达的影响。结果表明,马身猪皮下脂肪组织中NR1H3的表达量随日龄增加呈上升趋势,30日龄时表达量最低,240日龄时表达量最高,差异极显著(P<0.01)。与对照组相比,猪前体脂肪细胞中过表达NR1H3,脂肪细胞的脂滴数明显增多,下游靶标SREBP-1c和ChREBP的表达量极显著提高(P<0.01),且成脂关键基因FAS、C/EBPβ、PPARγ和FABP4的mRNA表达量极显著提高(P<0.01),促进成脂过程;相反,干扰NR1H3基因,脂滴数明显减少,下游靶标及成脂关键基因的mRNA表达量极显著下调(P<0.01),抑制成脂过程。本研究表明,NR1H3基因是猪前体脂肪细胞成脂分化的正调节剂,通过影响其下游靶标SREBP-1c和ChREBP的表达而影响成脂分化,研究结果对阐明猪脂肪沉积的分子机理、改善肉质品质有重要意义。     

KLF11抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在获得山羊Krüppel样因子11(Krüppel-like factor 11,KLF11)基因序列,明确其组织及细胞表达模式,阐明KLF11对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能作用途径。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测KLF11在山羊各组织及成脂诱导分化不同阶段细胞中的表达水平,利用油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子生物学等角度确定干扰KLF11后对山羊肌内脂肪细胞分化的影响及可能的作用途径。结果表明,KLF11核苷酸序列总长为1 752 bp,CDS区为1 518 bp,编码505个氨基酸残基。KLF11基因在山羊各个组织中都有广泛表达,并且在肝、背最长肌及腹部脂肪中存在较高水平表达;KLF11在成脂诱导48 h的山羊肌内脂肪细胞中表达水平极显著高于诱导分化前(P<0.01)。筛选到干扰效率可达到63.58%的KLF11-siRNA1有效干扰序列,转染山羊肌内前体脂肪细胞后发现可明显促进山羊肌内脂细胞的脂滴积聚,且脂肪细胞分化标志基因PPARγ和C/EBPβ mRNA水平出现极显著上调(P<0.01),Pref-1 mRNA水平出现极显著下调(P<0.01);干扰KLF11基因后,KLFs有些成员(KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、KLF8、KLF10、KLF14、KLF16)表达水平发生极显著下降(P<0.01),有些(KLF15)则出现相反的表达模式。KLF11基因可能通过调控PPARγ、C/EBPβ和Pref-1的表达抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化,并且这种作用可能是通过协同KLF2、KLF4、KLF10,拮抗KLF7和KLF15来进行的。     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性，预测miR-17-3p的靶基因；通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达；采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系；使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明，生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因，且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性；转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）；抑制miR-17-3p的表达后，PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）；过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）；而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明，miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。