产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选及其产酶条件研究

利用设计的低廉简便的凝胶法从土壤中分离得到1株高产谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutami-nase,MTG)的菌株,初步鉴定属于放线菌纲的链霉菌属(Streptomycessp.)。摇瓶发酵试验表明,其最适产酶氮源和碳源分别是蛋白胨和葡萄糖,通过正交试验确定最适产酶培养基为(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母提取物3.0,MgSO4·7H2O2.0,K2HPO4·3H2O2.0,KH2PO42.0,CaCO35.0。单因素试验确定最佳培养时间和最适pH分别为72h和7.0;在优化条件下,发酵液中MTG酶活达1.04U/mL。     

产纤维素酶菌株的分离·筛选及酶活性测定

[目的]寻找更多高效降解纤维素的新菌种及其科学利用方法。[方法]利用“采样－培养－分离单菌落－初筛－复筛－测OD值”的方法筛选出分解纤维素能力较强的菌株。[结果]经反复培养和划线分离从80份样品中初选出35株具有分解纤维素能力的菌株。其中10株由白转绿,长势较好;6株深绿色,长势一般;4株绿色,长势较好。这20株都产孢子,被初步鉴定为绿色木霉。用刚果红培养基进行复筛选,得到9株透明圈较大的菌株。将这9株菌株再进行发酵培养,用DNS法进行酶活测定得到2株酶活较强的菌株。这2株菌株被鉴定为棘孢木霉。通过滤纸崩解测试筛选出20株降解纤维素能力较强的菌种。DNS法酶活测定结果表明采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2个菌株的产酶活性最高。[结论]采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2个菌株可以作为降解纤维素的新菌种。     

纤维素酶产生菌的筛选、鉴定和产酶条件优化

采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态、生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件。结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。1.25%麦芽浸粉为碳源、1.5%KNO3为氮源、0.2%的NaCl、0.1%的CMC-Na、接种量6%、培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件。优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%。     

高产谷氨酰胺转胺酶茂原链霉菌的快速筛选

【目的】考察茂原链霉菌单菌落表面纹饰特征及边缘特征与产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)能力的关系,建立一种根据菌落形态快速初筛高产株的方法。【方法】通过自然选育,将原始菌株分离纯化后得到不同形态的单菌落,从中选出典型的表面纹饰特征和边缘特征单菌落。用试管发酵48h后测定各形态菌落的酶活,并通过摇瓶发酵验证依据菌落形态特征初筛MTG酶高产株方法的可行性。【结果】表面厚实饱满呈馒头型且边缘毛糙的菌落酶活最高,而表面平薄、边缘光滑的菌落酶活最低。根据这一形态鉴定法,通过摇瓶发酵,筛选出了一株产MTG酶活高达6.33U/mL的菌株,其活性比原始出发株提高了20.1%。【结论】根据菌落形态筛选MTG酶高产株的方法是可行的。     

药用植物土壤中拮抗放线菌的分离、筛选及初步鉴定

从五味子、穿山龙、人参等19份辽宁药用植物土壤样品中共分离到放线菌272株,采用对峙培养法筛选到对穿山龙黑斑病病原菌有拮抗性菌株38株,复筛结果表明:菌株LJG66,SWJ225,SWJ211对人参锈腐病病原菌,穿山龙黑斑病病原菌,草莓灰霉病病原菌抑菌效果均较好。其中,SWJ225的96 h发酵液对穿山龙黑斑病抑菌圈直径可达到30 mm。经初步鉴定,3株放线菌均属链霉菌属。     

胆固醇氧化酶快速鉴定方法研究

[目的]建立胆固醇氧化酶的快速鉴定方法。[方法]采用初筛和复筛试验,从21种不同来源的样品中筛选出9株高酶活胆固醇氧化酶菌株,采用定性平板检测法、过氧化氢法、羟醛反应法、薄层层析法等定性检测胆固醇氧化酶的活性。[结果]从21种样品中共筛选出48株胆固醇氧化酶菌株,用定性平板检测法从中筛选出9株高酶活菌株（2-6、15-3、3-3、16-5、3-4、4-3、4-6、JM109和10192）,其中4．6酶活最高;过氧化氢法共鉴定出6株高酶活菌株,与定性平板法检测结果一致;薄层层析法可定性检测出胆固醇氧化的唯一产物胆甾4-烯-3-酮。[结论]定性平板检测法和薄层层析法可快速、有效的鉴定出高酶活胆固醇氧化酶菌株。     

一株产纤维素酶放线菌的分离鉴定及酶学性质研究

为探究产纤维素酶放线菌的生物学特征及其酶学性质,从土壤中筛选产纤维素酶放线菌,试验采用平板稀释法并结合刚果红染色法对土壤中的纤维素分解菌进行初筛,通过酶活测定复筛,筛得产纤维素酶能力较高的放线菌一株,对该菌株进行形态学、分子生物学及生理生化鉴定,并对酶学性质进行研究。结果表明:该菌在液体发酵中的内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶及滤纸酶活分别为30.06,10.40,8.05和13.88U·m L~(-1);通过对该菌株基因组中编码16S r RNA的DNA序列测序,得到一段1401bp的碱基序列,通过进化树分析可确认该菌为链霉菌属;在酶学性质研究中,该菌所产内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶及滤纸酶的最适pH值为4.5,外切酶、β-葡萄糖苷酶及滤纸酶的最适反应温度均为50℃,内切酶的最适反应温度为55℃;金属离子Mg~(2+),Ca~(2+),Mn~(2+)对纤维素酶均有激活作用,其中内切酶在pH值4.0~6.5间及在30~60℃的反应温度下,其相对酶活能在70%以上。试验获得的放线菌所产内切酶的酶活和酶适应性较好,为酸性纤维素酶,可为进一步研究放线菌纤维素酶及其生产利用提供理论依据。     

一株絮凝剂产生菌TS-1的分离与鉴定

[目的]筛选鉴定出高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌。[方法]通过培养基培养分离纯化出高絮凝活性的菌株并通过培养特征观察和生理生化特征测定鉴定筛选出的菌株。[结果]通过用稀释涂布平板法和平板划线法从土壤中分离、纯化和初筛后,从供试土样中共分离到14株具有絮凝性能的细菌,经复筛后得到5株絮凝活性较高（絮凝率〉70%）的絮凝剂产生菌,其中1株经多次传代培养后絮凝活性仍很稳定（絮凝率始终〉90%）,其标记为TS-1。TS-1菌为具有荚膜的革兰氏阳性杆菌,并且菌体内无类脂物质如聚β-羟基丁酸。TS-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,故将该菌定名为Bacillus TS-1。[结论]该试验筛选出的菌株可用于淀粉工业废水的絮凝处理和生化处理。     

湛江湖光岩土壤放线菌分离与抗菌活性测定

采用6种不同的方法对湛江湖光岩地质公园的土壤进行预处理,用释稀涂布方法进行放线菌的分离．并对获得的放线菌进行形态、生理生化常规鉴定与抗菌活性测定。试验结果表明。新鲜土壤经28～30℃风干10d的预处理,能够有效地抑制细菌和真菌的生长．且有利于放线菌的分离。该法共获得23株菌落形态疑似不同的放线菌,经常规鉴定,4株菌株初步确定为诺卡氏菌属．2株菌株为小单孢菌属．17株菌株为链霉菌属。另外．有9株菌株具有抑制大肠埃氏菌活性;8株具有抑制金黄色葡萄球菌活性．获得3株菌株同时具有抑制大肠埃氏菌与抑制金黄色葡萄球菌活性。     

玉米秸秆还田土壤中纤维素分解菌的分离筛选和鉴定（摘要）

[目的]从玉米秸杆还田土壤中分离筛选出酶活力较高的纤维素分解苗。[方法]通过CMC固体培养初筛和摇床培养复筛从玉米秸秆还田土壤中筛选出纤维素酶活力较高的菌株,并对其进行16rDNA序列分析。[结果]通过初筛和复筛获得了内切酶活力较高的1株细菌和1株真菌,滤纸酶活力较高的1株真菌和2种酶活均较高的1株细菌（5号菌株）。16SrDNA序列分析结果表明,5号菌株与Bacillus subtilis的相似性达到100%。[结论]5号菌株鉴定为枯草芽炮杆菌     

低场NMR法研究微生物转谷氨酰酶对猪肉肌原纤维蛋白凝胶功能特性的影响

用低场核磁共振(NMR)研究了微生物转谷氨酰酶(MTG)对猪肉肌原纤维蛋白凝胶质子核磁共振弛豫行为的影响.研究结果显示,NMR结果拟合后得到的水有4个组分,合并为对应水的3种状态即结合水、不易流动水和自由水.和对照相比,加酶处理后显著降低了猪肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶的自旋-自旋弛豫时间(T2).加入2 U·g-1剂量的MTG后,T22b值(对应于不易流动水)由226 ms(峰值)降低到188 ms.然而,当酶浓度增加时,T22b没有进一步降低.对衰减NMR信号拟合结果进行主成分分析显示,前两个主成分可以解释变异方差的80%,并且加酶和对照在样品评分图上显著分开.加入MTG后,凝胶中水质子的移动性显著下降.     

溶氧浓度对微生物谷氨酰胺转胺酶发酵的影响

研究了不同溶氧(DO)浓度对微生物谷氨酰胺转胺酶(M TG)发酵的影响。结果表明,当溶氧浓度为2.88 m g/L时,M TG活性和菌体干重最高,分别达到4.32 U/mL和23.5 g/L,底物利用率为81.6%;当溶氧浓度继续升高时,发酵后期M TG活性下降显著。为此采用了分阶段溶氧控制策略,即在0~34 h控制溶氧浓度为2.88m g/L,34 h后控制溶氧浓度为0.96 m g/L,最终M TG活性达到4.72 U/mL,菌体干重达到27.32 g/L,较恒定2.88 m g/L溶氧浓度时分别提高了9.26%和16.26%,其底物利用率达83.2%。     

全子叶生物活性豆腐凝胶特性的研究

通过因子筛选实验,确定了接种量、微生物转谷氨酰胺酶(MTG)用量和水豆比是影响全子叶生物活性豆腐凝胶特性的关键因子。在此基础上,采用响应曲面法(Response SurfaceMethodology,RSM)分别建立了豆腐硬度和持水率的二次多项数学模型,验证了模型的有效性并探讨了上述3个因子的交互作用。从产品成本和凝胶特性综合考虑,选择出最佳配比,即乳酸菌接种量为105cfu/mL,MTG用量为347 U/L,水豆比为8.5,其硬度和持水率实测值分别为44.8g和89.2%,可生产出富含乳酸菌和几乎全部大豆营养的健康豆腐。     

产纤溶酶菌株的分离筛选

以脱脂奶粉作为初筛底物,纤维蛋白作为复筛底物,透明圈作为筛选标记,从肉联厂,污水沟等地筛选出产纤溶酶的菌株40株,从中筛选出产酶活力最高的2号菌株,将其编号为ZLW-2,并采用改进的紫外分光光度法测酶活,提高了酶活测定的精确性,对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。菌株ZLW-2的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌体大量生长以后酶活力才开始增加。     

西北地区盐渍土中抗动物病原菌的拮抗放线菌筛选

对西北地区盐渍土中放线菌种类组成及拮抗性放线菌进行了相关研究.结果表明:该地区盐渍土中放线菌以链霉菌属为主,同时拮抗性放线菌所占比例较高,且广普性拮抗菌较多.试验中以固体琼脂块法和液体发酵法相结合,共筛选出10株对鸡的大肠杆菌、牛的无乳链球菌等多种动物病原菌有较强抑菌作用菌株,并对其进行了初步鉴定,其结果为:10株菌株均为链霉菌,其中黄色类群3株,粉红孢类群及球孢类群各2株,烬灰类群、绿色类群和淡紫灰类群各1株.     

番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究

[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质。[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌。研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定。[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质。[结论]为开发新的生防制剂奠定了基础。     

一株拮抗稻瘟病菌的放线菌筛选及初步鉴定

从采自全国各地的48份土样中分离得到放线菌403株。以水稻稻瘟病菌为指示菌,利用平皿对峙法筛选到30株具有较好拮抗作用的菌株,其中菌株WM2-4的拮抗作用最强,抑菌带宽度为22.2mm。结合抑制菌丝生长速率法进行复筛,结果表明菌株WM2-4对稻瘟病菌的抑制效果最好,抑制率为89.35%。根据形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rDNA序列比对分析,初步鉴定菌株WM2-4为鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)。     

鸡屎藤与鱼鳅串和抗生素联合抑菌试验研究

[目的]考察鸡屎藤、鱼鳅串水提物的体外抗菌活性及其与常用抗生素的联合抑菌效果。[方法]以金黄色葡萄球菌CMCC29178和大肠埃希氏菌ATCC25922标准菌株为检测菌,采用微量肉汤稀释法测定其最小抑制浓度(MIC)和联合抑菌指数(FIC)。[结果]鸡屎藤、鱼鳅串水提物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌都具有一定的抑菌效果,与常用抗菌药物合用表现出不同程度的协同或相加效应。[结论]水提法可广泛用于对具有抗菌活性的植物药材的初步筛选。     

高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选

[目的]筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[方法]选用10株芽孢杆菌,采用染色法初选和3,5-二硝基水杨酸显色法复选对其产淀粉酶的能力进行测定,筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[结果]10株芽孢杆菌菌株中有9株具有产淀粉酶能力,其中编号为Pab03、Pab02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高,染色圈直径／菌落直径分别为2．284、1．961;在未作发酵条件优化的前提下,其酶活力分别达到（31．331±0．985）、（21．521±1．390）U,在作为新型的消化酶饲料添加剂方面具有广阔的应用前景。而菌株凝结芽孢杆菌PSAF1和枯草芽孢杆菌PJK01所产淀粉酶活力最低,分别为（0．366±0．022）、（0．704±0．089）U。[结论]成功筛选了2株高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株,分别为Pab03和Pab02。     

洋葱γ-谷氨酰转肽酶AcGGT的克隆与鉴定

【目的】葱属植物代谢产生的蒜氨酸具有重要的药学价值,γ-谷氨酰转肽酶是蒜氨酸合成中作为脱谷氨酰化步骤的关键酶。研究洋葱γ-谷氨酰转肽酶基因的功能,揭示γ-谷氨酰转肽酶在洋葱蒜氨酸合成途径中的作用,为体外合成蒜氨酸提供理论依据,为进一步深入研究洋葱蒜氨酸合成机制奠定基础。【方法】以洋葱为材料,依据洋葱RNA-seq数据库设计引物,利用RT-PCR从洋葱中克隆γ-谷氨酰转肽酶基因,并进行生物信息学分析;构建CaMV 35S-AcGGT-GFP载体,利用微粒轰击技术,以金粉-质粒微载体轰击洋葱内表皮细胞,构建带有AcGGT的酿酒酵母表达载体,转化并诱导表达AcGGT,利用γ-谷氨酰转肽酶催化谷氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺的方法测定转入AcGGT的酿酒酵母总蛋白的谷氨酰转肽酶活性;利用实时荧光定量PCR方法分析该基因在洋葱组织间差异表达模式;利用γ-谷氨酰转肽酶催化谷氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺的方法测定组织间内源性转肽酶酶活性。【结果】克隆获得AcGGT,长度为1 869 bp;生物学信息学分析显示,洋葱AcGGT编码622个氨基酸,蛋白保守结构域预测显示具有谷氨酰转肽酶结构域,二级结构主要以α-螺旋为主,跨膜区分析推测GGT蛋白具有跨膜区,氨基酸多重比对结果显示植物中的GGT具有一定的保守性,进化分析表明AcGGT与大蒜AsGGT2亲缘关系最接近。CaMV 35S-AcGGT-GFP融合蛋白的荧光信号位于液泡中,表明该基因编码蛋白位于液泡。外源表达AcGGT蛋白的谷氨酰转肽酶活性测定结果显示,转入AcGGT的酵母谷氨酰转肽酶活性显著高于对照,表明AcGGT编码的蛋白具有转肽酶活性。AcGGT组织差异表达结果分析显示,该基因的表达主要在叶鞘,鳞茎和叶鞘次之;不同组织谷氨酰转肽酶活性显示,在叶中活性最高,叶鞘次之。相关性分析显示组织间谷氨酰转肽酶活性与AcGGT表达相关性不显著。【结论】克隆了洋葱AcGGT。洋葱蒜氨酸合成途径中脱谷氨酰化先于S-加氧。AcGGT的表达与洋葱内源性的谷氨酰转肽酶活性相关性不显著,洋葱中可能存在多个谷氨酰转肽酶基因。