马铃薯Y病毒CP基因5′端和3′端反向重复结构介导的抗病性研究

本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)外壳蛋白(CP)基因(PVYNCP)5′端和3′端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKII-5′IR和pROKII-3′IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVYNCP基因3′端茎50 bp(环50 bp)hp RNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVYNCP基因5′端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVYNCP基因的3′端比5′端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

马铃薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重复结构介导的抗病性研究

 本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)外壳蛋白(CP)基因(PVY^N CP)5'端和3'端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKⅡ-5'IR和pROKⅡ-3'IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVY^N CP基因3'端茎50 bp(环50 bp) hpRNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVY^N CP基因5'端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVY^N CP基因的3'端比5'端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVY^N高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVY^N表现高度抗病的植株对PVY^O也具有高度抗病性。     

利用RNA干扰介导抗病性获得兼抗四种病毒的转基因马铃薯

为获得兼抗马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)和马铃薯潜隐花叶病毒(Potato virus S,PVS)4种病毒的转基因马铃薯新材料,分别以这4种病毒全长CP基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得4种病毒CP基因相对保守区段的基因片段,并将其拼接成融合基因,以载体pHANNIBAL和pBI121为基础,构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,利用农杆菌介导的转基因体系进行马铃薯遗传转化,并对获得的转基因马铃薯进行病毒抗性检测。结果表明,所获得的融合基因片段RH1和RH2,酶切鉴定分别得到长度为1 200 bp的条带,与预期片段相符;构建了含pdk内含子和RH1、RH2融合基因的RNAi植物表达载体,经Bam H I/Sac I双酶切,获得长度约3 200 bp的片段,表明RNAi植物表达载体pBI121-pRH构建成功;转化易感病毒马铃薯品种陇薯11号,PCR检测和PCRSouthern杂交分析表明融合基因已整合到陇薯11号马铃薯基因组中;抗病性检测显示4株转基因马铃薯植株对4种病毒均免疫。表明利用RNAi可筛选出抗多种病毒的转基因马铃薯新种质。     

高温激活RNA沉默介导的心叶烟抗病毒防御反应

 在真核细胞内,RNA沉默是一种保守的抵抗病毒及外源基因等寄生分子的防御机制。温度可以明显地影响植物体与病毒之间的相互作用。在常温状态下,常常会伴随病毒病的爆发,但在较高温度下,症状则会减轻,甚至有些感病植株新生叶片可以较快地恢复健康。目前这类现象的内在机制还不完全清楚。本文通过定量分析不同温度下马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的心叶烟(Nicotiana glutinosa)植株体内病毒蛋白含量,结合症状观察,确定30℃左右是PVX和PVY在心叶烟上引起症状消失即发生系统性RNA沉默的临界温度,此时的感病植株上部新生展开叶片呈现无症状态,下部已发病叶片症状不变。在常温时,由病毒激发的RNA沉默会受到抑制,病毒来源的小分子干涉RNA (small interfering RNAs,siRNAs)含量极少或根本检测不到,植株对于病毒的敏感性较强。当温度达到30或32℃时,感病植株下部症状保持叶片中,病毒起源的siRNAs含量明显增加,而上部新生健康叶片中却检测不到siRNAs的存在。这说明高温激活了RNA沉默介导的植物抗病毒防御反应,导致病毒症状减轻甚至消失。     

利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

 RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。     

烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)介导的体外复制体系

通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)中国分离物RdRp的编码序列,构建以pMALC2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。温度梯度实验显示,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBPRdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3'末端序列,催化体外复制;对正负链的3'末端的体外复制效率存在差别,识别负链3'末端的体外复制效率明显高于正链3'末端。本研究创建的TBTV RdRp介导的体外复制体系为进一步研究TBTV基因组复制调控奠定了基础。     

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

 为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。     

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

 根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。     

dsRNA分解酶PAC 1对4种植物病毒、3种类病毒dsRNA的降解活性检测及转pac 1基因烟草的获得

 将来自粟酒裂殖酵母的pac 1基因,导入原核表达载体pET-5a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,其表达产物能够降解4种植物病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、Tobacco mosaic virus(TMV)、Rice black-streaked dwarf(RBSDV)和Rice dwarf virus(RDV)和3种类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)、Coleus blumei viroid(CBVd)和Hopstunt viroid(HSVd)的dsRNA。将pac 1导入双元载体pBI121,并转入根癌农杆菌LBA4404,以烟草(品种NC89)组培苗的叶片为受体材料进行转化,经过诱导愈伤、分化、再生和筛选培养,获得了50株Kan抗性植株,收获T₁种子分别播种,对这些转基因植株进行分子生物学检测。PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测结果表明,pac 1基因已整合到受体基因组中。     

马铃薯Y病毒云南昭通烟草分离物的检测及年度间差异比较

利用DAS-ELISA检测试剂盒检测昭通烟草脉斑病样品,结果表明存在马铃薯Y病毒O株系和马铃薯Y病毒N株系两个不同株系病毒。利用Sprimer和M4引物扩增、克隆、测序,得到长度为1 771 bp目的片段,该片段包含病毒的外壳蛋白基因序列、3′ UTR序列以及部分Nib基因序列;序列分析表明与湖南HN 2分离物（GenBank No. GQ200836）和美国NE 11分离物（GenBank No. DQ157180）核苷酸序列相似性均为98%,系统进化分析表明其具有较近的亲缘关系。     

地高辛标记的cDNA探针检测烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒及马铃薯Y病毒

 根据已发表的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,分别以提取的TMV、CMV和PVY侵染的病叶总RNA为模板,反转录PCR进行体外扩增,分别得到长度为0.44、0.77、0.80 kb的目的片段,并克隆到pGEM-T easy质粒载体上,以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的双链DNA探针。以合成的探针通过斑点杂交技术检测烟草病叶总RNA和烟草病叶汁液。TMV、CMV和PVY的3种地高辛探针检测各自感染的烟草病叶总RNA的稀释低限分别为1:1000、1:10000、1:320,检测各自侵染烟草病汁液的最大稀释倍数分别为1:100、1:100、1:10,而每种探针与健康烟草和其它2种病毒的反应均为阴性。     

瞬时表达比较2种不同的RNAi载体的干涉效果

 RNAi with natural defence mechanism of homologous RNA degradation is widely used in research of antiviral plant. It is important to construct a highly efficent RNAi vector for transgenic plants of virus resis-tance. In this study, part fragments of coat protein gene of Potato virus Y (PVY) (451-750 bp) were inserted into the two expression vectors. Vector pROKY300 without intron and pHelY300 with PDK and CAT introns on the hpRNA stem were constructed. The silence efficiency of virus resistance of the two vectors was investigated as 88% (22/25)for pROKY300 and 92% (23/25) for pHelY300 through transient expression mediated by agroinfiltration. The results showed that both vectors were highly antiviral and elucidated the validity of RNAi-medicates resistance to virus.     

Complementation of coat protein mutants of pepper huasteco geminivirus in transgenic tobacco plants

ABSTRACT The role of the pepper huasteco virus (PHV) coat protein (CP) gene during the infection was investigated in three different hosts by using mutations that produced truncated proteins and by complementation assays in transgenic plants. The infectivity analysis revealed that mutants that express truncated CP (CP7 and CP191) behave like the wild-type virus when inoculated onto pepper and Nicotiana benthamiana plants in terms of symptom expression and viral DNA movement. On the contrary, the CP7 mutant was unable to systemically infect tobacco plants, whereas only 10% of the plants inoculated with the CP191 mutant became infected. The CP7 mutant was complemented by coinoculating it with another geminivirus (taino tomato mottle virus). No complementation was observed in plants from nine transgenic tobacco lines expressing CP under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. However, 3 out of 10 lines expressing CP under the control of its own promoter (693 nucleotides) were able to complement the CP7 mutant. Interestingly, upon infection, the levels of CP mRNA in 693CP plants increased dramatically, probably due to transactivation of the CP promoter by the viral protein AC2.     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

Effect of temperature on resistance to Potato virus Y in potato cultivars carrying the resistance gene Rychc

The effect of cultivation temperatures on the resistance reaction to three Potato virus Y strains (PVY^O, PVY^N and PVY^NTN) in potato cultivars carrying Ry_chc was examined. When potato plants carrying Ry_chc were cultivated at 22 °C, a few small necrotic spots developed on inoculated leaves by 5 days after mechanical inoculation (dpi), and systemic infection of a few symptomless plants was confirmed at 28 dpi by IC‐RT‐PCR. At 28 °C, distinct necrotic spots developed on inoculated leaves by 5 dpi, and systemic symptoms occasionally appeared at 28 dpi. Thus, high temperature weakens Ry_chc‐conferred resistance. However, the incidence of systemic infection and the titre of virus in resistant cultivars at 28 °C were lower than in a susceptible cultivar. In graft inoculation under high summer temperatures, some plants developed necrosis on the leaves and stem, but PVY was barely detected by RT‐PCR in leaves on potato carrying Ry_chc. When seedlings from progeny tubers of plants that were inoculated with PVY and grown in a greenhouse at >30 °C in the daytime were examined by ELISA and IC‐RT‐PCR, PVY was not detected in cultivars carrying Ry_chc. These results show that Ry_chc confers an extreme resistance to PVY strains occurring in Japan.