马铃薯Y病毒CP基因5′端和3′端反向重复结构介导的抗病性研究

本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)外壳蛋白(CP)基因(PVYNCP)5′端和3′端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKII-5′IR和pROKII-3′IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVYNCP基因3′端茎50 bp(环50 bp)hp RNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVYNCP基因5′端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVYNCP基因的3′端比5′端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

转基因烟草中PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性受温度的调控

 本研究以转不可翻译的马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)烟草的T₃代植株为材料,在获得高度抗病植株并证明转基因植株的抗病性是由RNA沉默介导的基础上,采用Northern杂交及ELISA检测病毒的方法,分析了温度对转基因烟草中RNA沉默以及转基因植株抗病水平的影响。结果表明,低温可以改变转基因植株中已发生的RNA沉默和转基因植株的抗病状态。在15℃低温下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默被抑制,转基因植株失去了对PVY^N高度抗病的特性,表现感病症状;而在25℃或以上高温(30℃、35℃)下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默没有发生被抑制的现象,转基因植株对PVY^N病毒的侵染仍保持高度抗病性。     

马铃薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重复结构介导的抗病性研究

 本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)外壳蛋白(CP)基因(PVY^N CP)5'端和3'端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKⅡ-5'IR和pROKⅡ-3'IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVY^N CP基因3'端茎50 bp(环50 bp) hpRNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVY^N CP基因5'端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVY^N CP基因的3'端比5'端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

 根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。     

马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性

为探究靶序列位置对RNA介导的病毒抗性产生的影响,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)复制酶基因(nuclear inclusion b,NIb)不同位置的cDNA区段,反向插入双元载体pROKII中,构建了发夹RNA(hairpin RNA,hpR-NA)结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。攻毒试验表明:PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异;3′端1/2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性,抗性植株的比例在50%以上,而5′端、5′端1/2处和3′端的序列介导的抗性效率较低,抗性植株的比例仅为10%~30%。Northern杂交显示:抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。     

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

 为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。     

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVY^N高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVY^N表现高度抗病的植株对PVY^O也具有高度抗病性。     

利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

 RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。     

hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3'端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。     

两种人工接种方法鉴定RNA干涉介导的转基因玉米对矮花叶病的抗性

本研究采用两种人工接种方法,以玉米成株期病情指数为指标,鉴定了63个转基因玉米株系的田间抗病性。结果表明,T4代转化株系‘47’和‘13h2-3’的抗病性达R抗级,超过抗病对照‘H9-21’。有82.5%(52/63)的转基因株系抗病性比未转化对照显著提高,表明用反向重复的RNA干涉表达载体转化玉米,可获得转基因抗病毒材料,且干涉片段适度延长可增加获得抗病材料的几率。另外,本文通过两种病毒接种方法的比较,发现采用玻璃纤维刷苗床穿刺接种比常规石英砂摩擦接种具有更小的误差。     

Tissue culture methods for the screening and analysis of putative virus-resistant transgenic potato plants

ABSTRACT Following regeneration, putative virus-resistant transgenic plants are usually transferred from tissue culture to a greenhouse or growth chamber to screen for resistance to infection and disease development using mechanical, graft, or insect vector inoculation methods. To reduce initial screening costs and time, we developed mechanical and graft inoculation methods suitable for tissue culture use. The in vitro methods were validated by comparing them with similar greenhouse screens using putative potato virus Y strain o (PVY degrees ) replicase-mediated resistant regenerants of the potato cultivar Atlantic. Five transgenic lines were tested, with similar results obtained from in vitro and greenhouse experiments. Two of the transgenic lines, A1 and A3, showed the greatest resistance to PVY degrees infection, as indicated by low enzyme-linked immunosorbent assay values and infection rates. In vitro mechanical inoculation methods were also used to infect wild-type tomato and tobacco plants with cucumber mosaic virus and potato virus Y. Potato plants were also infected with the phloem-restricted potato leafroll virus, a low-titer virus, using in vitro graft inoculation methods. These results suggest the potential usefulness of these simple, effective, and economical techniques for screening large numbers of putative virus-resistant plants.