龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

依据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,利用RT-PCR结合RACE技术,以龙眼胚性愈伤组织c DNA为模板,获得Dl AGO6基因的c DNA全长序列,共3 168 bp(登录号为KF819529),完整开放阅读框2 700 bp,编码900个氨基酸。生物信息学分析表明:Dl AGO6的c DNA所编码的氨基酸序列含有2个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与拟南芥AGO6蛋白序列有较高的同源性。龙眼体胚发生过程中Dl AGO6表达量的q PCR分析表明:Dl AGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织时期的表达量最高,在鱼雷形胚时期表达量最低,推测DLAGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段的高表达量,可能与细胞的旺盛分裂有关。     

葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析

利用RT-PCR技术从葡萄中克隆到两个查耳酮合酶(CHS)的c DNA开放阅读框(ORF)序列,分别命名为Vv CHS1和Vv CHS3。其中,Vv CHS1序列长1 182 bp,编码393个氨基酸;Vv CHS3序列长1 170 bp,编码389个氨基酸。对两个CHS基因编码的氨基酸序列的分析表明,二者均具有CHS基因家族的保守结构域。多序列比对和系统发生分析结果表明,两个CHS基因与其他高等植物CHS基因具有较高的相似性,然而Vv CHS1和Vv CHS3在结构和功能上出现歧化。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。     

龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达

【目的】克隆龙眼Dimocarpus longan己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因,并对其进行生物信息学分析及原核表达分析.【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得基因全长c DNA序列,构建p ET-32a-Dl HXK原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中诱导表达.【结果和结论】成功克隆龙眼己糖激酶基因的c DNA全长序列,命名为Dl HXK,登录号为KF776906.1.龙眼Dl HXK序列全长2 101 bp,包括1个1 488 bp的开放阅读框,预测编码495个氨基酸;进化树和相似性分析发现,该基因与温州蜜柑Citrus unshiu的相似性最高,达到了82%;荧光定量表达分析表明,Dl HXK基因随着果实的发育成熟表达量逐渐上升;经IPTG诱导和SDSPAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白大小相吻合.由此可见,利用RT-PCR结合RACE方法成功克隆了龙眼的己糖激酶基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中获得高效表达.     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

太子参GAPDH基因的克隆及序列分析

为了获取可靠内参基因,采用同源克隆技术和c DNA末端快速延伸技术,首次从太子参中克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的部分c DNA序列,命名为Ph GAPDH,序列长度为981 bp,包含699 bp的部分阅读框,推测其编码232个氨基酸,还含有282 bp的3'UTR。序列分析结果表明,太子参Ph GAPDH基因编码的氨基酸序列与同科植物香石竹(Dianthus caryophyllus)氨基酸序列同源性高达99%。PCR分析结果表明,Ph GAPDH基因在太子参不同种源块根、同一种源不同组织及不同生长时期的表达水平较稳定,可以作为太子参功能基因研究的内部参考基因。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

香草兰VpLFY基因的克隆与表达分析

花分生组织特征基因LEAFY在植物花芽分化与成花诱导途径中起着重要的调控作用。通过RACE方法从香草兰中克隆Vp LFY基因的全长c DNA序列。结果显示,该基因包含一个1 493 bp的开放阅读框,编码491个氨基酸残基。经蛋白质序列同源比对分析结果发现,Vp LFY属于FLO-LFY家族。组织特异性研究结果表明,Vp LFY基因在香草兰组织中属于组成型表达。荧光定量分析结果表明,Vp LFY基因分别在香草兰纯花芽和混合花芽的不同发育阶段中有着较强的表达。     

桂花OfFCA基因的克隆及在花芽分化时期的表达分析

  目的  桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物，其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。  方法  以桂花品种‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhonggui’为材料，采用石蜡切片观察其花芽分化进程，运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA（FLOWERING LOCUS CA）基因分别进行克隆及表达特异性分析。  结果  克隆得到OfFCA cDNA序列长为1 319 bp，其开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现:OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高，同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期，无论叶还是花芽中，19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。  结论  桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化，参与桂花的花芽分化，使桂花的花期提前。     

山核桃FLOWERING LOCUS C同源基因鉴定与表达分析

 根据本课题组对山核桃Carya cathayensis花芽454测序获得的CcFLC基因的2个开放阅读框（ORF）分别设计引物并进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,获得开放阅读框大小分别为639 bp和612 bp,编码212个和203个氨基酸,GenBank登录号分别为JQ829074和JQ829075,都具有典型的MADS-box结构域,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78%和67%,5′端高度同源,3′端差异较大。与太行花Taihangia rupestris和梨Pyrus pyrifolia等物种的FLC-like基因的氨基酸序列同源性达到40%~57%。氨基酸疏水性分析显示,它们的羧基端都是疏水性氨基酸,而氨基端是亲水性氨基酸,大部分氨基酸残基是疏水性的。实时定量PCR结果显示：CcFLC基因的2个开放阅读框在山核桃的营养枝的幼茎、幼叶、顶芽,以及短果枝的雌花芽和雄花芽中都有表达,但相对表达量存在较大差异,同一组织中ORF1 的表达丰度明显高于ORF2。ORF1 表达量在茎中最高,但在叶和雄花芽的表达量最低;ORF2 在雌花芽中相对表达量最高,茎中表达量最低。图7参23     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的c DNA序列,命名为Hb Ca M1-7。序列分析结果发现,Hb Ca M1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,Hb Ca M1-6间氨基酸同源性为100%,Hb Ca M7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,Hb Ca M1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,Hb Ca M1-6在各组织中均有表达,除了Hb Ca M3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而Hb Ca M7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,Hb Ca M2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中Hb Ca M1-5碷呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

梅花PmCBFa基因的克隆与序列分析

为了找到梅花抗寒关键基因,进一步了解梅花的抗寒分子机理,在分析了NCBI核苷酸数据库中已公布的CBF/DREB1同源基因序列基础上,通过基因同源克隆结合RACE技术,在‘雪梅’花蕾cDNA文库以及‘雪梅’gDNA中均成功扩增得到梅花的1个CBF/DREB1类基因,命名为PmCBFa。该基因CDS区全长845bp,编码231个氨基酸。经核苷酸序列分析、预测编码氨基酸序列比对分析以及编码蛋白系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白具有CBF/DREB1类转录因子保守的AP2结构域及其两翼结构序列,且与桃的DREB1同源蛋白同源性最高。该研究结果为后续PmCBFa基因在梅花抗寒分子机理的研究中提供了理论依据,为梅花抗寒育种开辟了新的途径。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

烟青虫气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

 根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I（GOBP1）和性信息素结合蛋白（PBP）基因的cDNA序列，设计了2对引物，以烟青虫Helicoverpa assulta触角cDNA为模板，分别进行PCR扩增，获得2条特异性条带，约400 bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上，获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明，Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp，编码147个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为17.2 kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405 bp，编码135个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为15.1 kD和5.2。Hass-GOBP1和Hass-PBP具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基，呈酸性。这2个基因已在GenBank中登记，序列号分别是AY864774和AY864775。