双功能木霉突变菌株的筛选和功能分析

研究从木霉菌REMI突变株中筛选到16株对氰化物具有明显降解活性,将其与5种常见病原菌对峙培养,得到7株拮抗性较高的突变株。对这7株转化子进行盆栽试验表明:多数供试转化子对黄瓜幼苗枯萎病具有明显的防效,其中转化子TkA8的防治效果最好,达到了73.5%。同时研究发现TkA8处理黄瓜幼苗可诱导防御反应相关酶系PAL、POD活性明显增加,分别为对照的3.21和4.25倍。因此TkA8是一种具有防病和生物修复氰化物污染的较理想的多功能木霉菌株。     

木霉菌REMI转化子解磷筛选及其解磷效果分析

[目的]为了获得具有防病和解磷双重功能的木霉菌REMI转化子。[方法]从康氏木霉菌(Trichoderma koningii)T30及其60株REMI(限制性内切酶介导的基因整合技术)转化子中筛选出3株解磷作用较好的转化子,并研究不同碳、氮源对转化子TK!46解磷作用的影响。[结果]结果表明,碳源对转化子解磷能力影响较小,而氮源的作用较大,其中转化子在解磷过程中最适氮源是氨态氮。[结论]该研究为研制多功能木霉剂奠定了基础,但完全揭示木霉菌解磷机理仍需进一步研究。     

高产抗生素木霉菌株的选育及初步研究

为选育高产抗生素木霉菌株,利用在培养基中加入高浓度木霉菌代谢产物作为选择压力,通过紫外线诱变,以立枯丝核菌作为指示菌,结合平板对峙法、发酵产物平板活性测定法,筛选高产抗生素木霉菌株.经初筛、复筛共得到6株对立枯丝核菌具有较强抑制作用的突变株,进一步对突变株的发酵液进行活性测定,选育出了两株遗传稳定的高产抗生素木霉突变株TD103-UV-4和TD103-UV-13,生长速度分别是出发菌株的1.86倍和1.95倍,发酵产物抑菌活性明显提高.其中菌株TD103-UV-4发酵液对立枯丝核菌的抑制率在80%以上,并且对灰葡萄孢菌等植物病原菌有较强的抑制作用,产抗生素能力比出发菌株提高了47.1%.     

高效降解秸秆的深绿木霉菌ATMT突变株的筛选

以羧甲基纤维素粉或滤纸为唯一碳源,对深绿木霉菌T23的农杆菌介导的突变株进行了生长速度、产孢率、色素形成等形态学观测,同时,测定了滤纸酶酶活及羧甲基纤维素酶酶活,从中筛选出降解纤维素能力较出发菌T23显著变化的突变株7株。其中,多拷贝T-DNA插入突变株较单拷贝的突变株生长速度快,产孢率高。并且,这些突变株的发酵液呈明显的色素差异。突变株插入的拷贝数越多,酶活越强,在降解过程中这2种酶都观察到了产物的反馈抑制现象。     

木霉菌REMI突变菌株在降解敌敌畏中的作用（英文）

本研究对木霉菌T30野生株和限制性内切酶介导的DNA整合技术(REMI)构建的突变株进行降解敌敌畏能力和最佳条件的研究。结果表明,野生株和几个REMI突变株均能降解有机磷农药敌敌畏,但以突变株TK-3降解活性最高,其降解效率达98%。TK-3突变株降解有机磷农药效率取决于葡萄糖剂量、敌敌畏初始浓度、初始pH等。突变株降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为1 000μg/mL,最适pH为7.0,敌敌畏浓度500μg/mL。敌敌畏浓度超过1 000μg/mL则会抑制木霉菌降解能力。     

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。     

木霉菌REMI突变菌株在降解敌敌畏中的作用

本研究对木霉菌T30野生株和限制性内切酶介导的DNA整合技术(REMI)构建的突变株进行降解敌敌畏能力和最佳条件的研究。结果表明,野生株和几个REMI突变株均能降解有机磷农药敌敌畏,但以突变株TK-3降解活性最高,其降解效率达98％。TK-3突变株降解有机磷农药效率取决于葡萄糖剂量、敌敌畏初始浓度、初始pH等。突变株降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为1 000 μg/mL,最适pH为7.0,敌敌畏浓度500 μg/mL。敌敌畏浓度超过1 000 μg/mL则会抑制木霉菌降解能力。     

木霉菌及其REMI突变株与油菜联合吸附镉污染土壤研究

研究从木霉菌及其REMI(限制性内切酶介导的基因整合)突变株中,筛选对重金属镉具有较高耐受性和吸附能力的菌株,将其处理油菜品种沪油20,分析油菜与木霉菌联合吸收土壤中镉的效应。测量在镉胁迫条件下,不同木霉菌株与沪油20组合在株高、干重、相对生物量及镉净化率的变化。结果表明:在没有镉处理土壤条件下,野生菌T23可明显促进沪油20的生长,而在土壤有镉的胁迫条件下,突变株P6、H6可明显提高沪油20对土壤镉的净化率。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

致病疫霉生防木霉菌株筛选鉴定及生物学特性1）

通过拮抗研究和发酵液抑制致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发以及孢子囊释放游动孢子的研究,从6株生防木霉菌株中筛选出对致病疫霉菌具有生防作用的高效生防木霉菌株T-28,该菌株对致病疫霉的拮抗等级为I级,发酵液对菌丝生长抑制率为64．71％,孢子囊萌发相对抑制率为64．41％,孢子囊游动孢子释放相对抑制率为68．31％。经ITS PCR扩增产物分析,T-28菌株与Trichoderma harzianum Rifai的ITS序列具有99％的最大同源性,验证为哈茨木霉。对哈茨木霉T-28进行生物学特性测定发现其对生长温度、pH、碳源和氮源要求不严格,是具有广泛适应性和广阔应用前景的高效生防菌。     

Construction of engineering Trichoderma strains and their characteristics against tomato gray mold

The transformed Trichoderma strains Ttrm31, Ttrm34 and Ttrm55 were obtained from Trichoderma wild strain T21 mutated by REMI technique for more effective biocontrol of tomato gray mold (Botrytis cinerea) with Trichoderma agent. Those transformants appeared much better in biocontrol activity in vitro or in vivo against tomato gray mold were better than that of wild strain T21. The main results were as follow: The transformed Trichoderma strains were detected in their genetic …     

不同腐熟剂对水稻秸秆菌肥的降解效应和对蔬菜生长的影响

利用高产纤维素酶的木霉菌株对水稻秸秆进行生物降解.通过测定菌肥纤维素酶酶活性、葡萄糖含量以及氮、磷、钾含量指标,比较研究了7种不同配比腐熟剂降解水稻秸秆的效廊.结果表明:仅含木霉菌REMI突变株H6菌株腐熟剂(SDTI)制备的秸杆菌肥中羧甲基纤维素酶酶活、葡萄糖含量均最高,分别达3.48U·g~(-1)和17.14mg·g~(-1),与对照差异达极显著水平;滤纸酶酶活高于对照,但差异未达显著水平;秸秆菌肥中氮、磷、钾含量也均高于对照.盆栽试验表明,该秸秆菌肥能显著促进番茄和黄瓜的生长.     

Assessment of Gene Flow Through Detection of Sexual Compatibility Between Transgenic Rice with bar and Echinochloa crusgalli var. mitis

The possibility of gene flow between two varieties of transgenic rice with bar gene (Y0003 and 99-t) (male) and barnyard grass(Echinochloa crusgalli var. mitis ) (female) was studied by means of reproductive biology. The germination and growth of rice pollen grains on barnyard grass stigmas at 30 rmin, and 1 -4 h after crossing by hand were observed with an optical microscope. The results were compared with the germination and growth of barnyard grass pollen grains at the corresponding time after self-pollination. The results showed that germination and growth of the pollen grains of the two varieties were similar on barnyard grass stigmas, but differed significantly from self-pollination of barnyard grass. Pollen grains germinated and pollen tubes penetrated stigmas normally, and the number of pollen grains being condensing or releasing their inclusions or having released them increased with the time after self-pollination. Pollen grains of transgenic rice on the stigmas of barnyard grass couldn‘t germinate or grow normally after crossing, neither could they penetrate the stigmas of barnyard grass. Therefore, it could be concluded that the sexual incompatibility between transgenic rice with bar gene and barnyard grass is due to the rice pollen being unable to penetrate the stigma of barnyard grass. Further proof of incompatibility lies in the fact that the emasculated barnyard grass pollinated with the rice pollen grains could not seed.     

木霉工程菌株酯酶同工酶和可溶性蛋白的电泳分析

用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对木霉菌的野生菌株T21及其4株REMI转化子T31、T34、T47、T55的可溶性蛋白和酯酶同工酶进行了比较研究。结果表明各转化子之间、转化子与野生菌株之间的谱带均有差异。野生菌株T21及转化子T31、T34、T47、T55的蛋白谱带为22,21,19,17,24条;酯酶谱带为6,8,4,5,3条。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

莠去津的环糊精包合物对稗草幼苗除草效果的影响

以稗草为指示材料,用水培法研究了三嗪类除草剂莠去津的环糊精包合物对稗草幼苗除草活性的影响.试验结果表明:用不同浓度的β-环糊精(β-CD)包合物浸种处理后,能抑制稗草根系发育,达到提高除草效果和缓释的作用.当莠去津与β-CD包合物浓度均为6.5 mg·mL-1时,抑制效果达到最好,对稗草主根长、根鲜重、芽长和芽鲜重的抑...     

转基因水稻外源基因向稗草的漂移研究

[目的]研究转基因水稻中外源基因向同科杂草稗草的基因漂移情况。[方法]利用农杆菌介导的方法,获得稳定遗传的转hpt基因水稻株系,对转基因水稻田中自然生长和人工种植的稗草种子进行PCR检测,确定是否含有转基因成分。[结果]通过对多株杂草稗种子获得的22 000株幼苗的PCR检测,均未能检测到外源基因的存在。[结论]未发现稳定遗传的转基因水稻中外源基因向稗草的漂移。