抗戊唑醇禾谷丝核菌菌株对不同碳氮营养源的利用

用菌落直径法和菌丝干重法研究了查彼克（Czapek）培养基中葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘油5种碳源和硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠、尿素、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、胱氨酸、赖氨酸12种氮源对抗戊唑醇禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌株生长的影响,以探明抗性菌株和敏感菌株之间生理适合度的差异.结果表明,在不同碳源条件下,所有菌株都在蔗糖、甘油和葡萄糖中生长最快,培养7天后,菌落直径和菌丝干重分别可达3.1750～7.5667 cm和0.0334～0.0554g,在木糖和果糖中生长相对较慢;在相同碳源条件下,高抗菌株（WWL）的生长速度小于敏感菌株（WW）和中抗菌株（WX1和WX2）,敏感菌株和中抗菌株之间的生长速度差异不明显.在不同氮源条件下,所试菌株均能较好利用硝酸盐、亚硝酸盐、精氨酸和丙氨酸,菌落直径和菌丝干重分别可达6.2～8.8 cm和0.0336～0.0543 g,不能充分利用胱氨酸,菌落直径和菌丝干重分别仅为1.4217～3.4750 cm和0.0178～0.0297 g;在同一氮源条件下,高抗菌株的生长速度小于敏感菌株和中抗菌株,而敏感菌株和中抗菌株之间差异不明显.     

利用HPLC检测禾谷丝核菌菌丝对戊唑醇的吸收

建立了禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌丝吸收戊唑醇的反相高效液相色谱(HPLC)检测方法,样品经萃取净化后过HPLC检测,外标法定量。方法的最小检出量和最低检出浓度分别为0.2 ng和0.01 mg/kg,回收率及精密度高,能满足真菌抗药性机制研究中定量分析的要求。与传统的液体闪烁计数法相比,该方法成本低、简便、准确。同时,比较了用戊唑醇处理后,敏感菌株和不同抗性水平菌株对戊唑醇的吸收及药剂在菌株体内的积累情况。结果表明,在0.5 mg/L剂量下,戊唑醇在抗性菌株体内的积累浓度要小于在敏感菌株体内,处理后24 h,敏感菌株体内戊唑醇的浓度要比高抗菌株高127.74%,比两个中抗菌株也分别高47.72%和7.83%。     

利用荧光定量PCR检测禾谷丝核菌的相对生物量

小麦纹枯病是以禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染为主的小麦土传病害。为建立检测禾谷丝核菌在寄主小麦(Triticum aestivum)中的相对生物量的可靠方法,促进小麦抗纹枯病机制的研究,本研究克隆了禾谷丝核菌肌动蛋白基因RcActin的部分(3′端)cDNA,并设计了RcActin的特异引物。该引物不仅能区分禾谷丝核菌与寄主小麦,还能区分全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等常见小麦土传病害的病原菌,表明该引物能用于小麦纹枯病的分子检测,也能用于相对表达量的测定。利用相对定量法,以RcActin相对于寄主管家基因的相对表达量作为禾谷丝核菌相对生物量的指标,结果表明,此方法能准确反映禾谷丝核菌在寄主中的相对生物量和对小麦纹枯病抗性程度进行快速鉴定。     

禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性及抗药性菌系生物学特性

在含戊唑醇PDA平板培养基上，对禾谷丝核菌进行逐代处理，以诱导其抗药性菌系；比较抗性和敏感菌系的生物学特性，测定抗性菌系对其它杀菌剂的交互抗性。结果表明，选育至35代，对戊唑醇抗性达33．4倍。抗戊唑醇菌系与敏感亲本菌系相比，其菌丝生长速率、菌丝干重、菌核产生速率、菌核数及干重均存在差异。抗性菌系较敏感菌系对冬小麦幼苗的致病力减弱，但小麦返青后抗性菌系引起的发病率和严重度均较敏感菌系增强。戊唑醇抗性菌系对三唑酮、丙环唑、井冈霉素、福美双、噁醚唑和咯菌腈6种药剂分别产生了31．2、22．8、16．9、15．8、15．5和1．6倍的交互抗性。     

戊唑醇对立枯丝核菌的抑制作用及在水稻上的应用

戊唑醇是一种高效、广谱、内吸性强的三唑类杀菌剂。研究表明,在离体条件下其对立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kuhn菌丝生长具有很强的抑制作用,EC50值为0.509 μg/mL。无论在天然培养基(LBA)还是在半组合培养基(AEA)上,戊唑醇均会抑制菌核的产生,且菌核的产量随着药剂浓度的增加而降低;虽然其对菌核的萌发无影响,但对菌核萌发后菌丝的生长有强烈的抑制作用。温室试验结果表明,立枯丝核菌菌碟经戊唑醇处理后,其对分蘖期水稻植株的致病力随着药剂浓度的提高而下降;戊唑醇可很好地被水稻叶片和根系吸收,并输送到水稻的茎部;对水稻纹枯病具有保护和治疗作用,EC50值分别为58.03和62.53 μg/mL;对立枯丝核具有较长的持效期,800 μg/mL处理水稻7 d后再接种的防效为41.46%。田间药效试验表明,43%的戊唑醇悬浮剂在有效剂量116.10 g/hm2下两次喷药后15 d的防效达71.97%。该药剂在本试验剂量范围内对水稻安全。     

花生网斑病菌对渗透压的敏感性及戊唑醇胁迫下的膜透性

以花生网斑病的病原菌花生派伦霉为材料,选择对戊唑醇的抗性菌株与敏感菌株,比较两者对渗透压的敏感性,以及在戊唑醇胁迫下膜透性的差异,重点探讨抗戊唑醇菌株的生理生化特点。结果表明,随着试验设置的NaCl浓度的增加,培养环境渗透压的升高,敏感菌株和抗性菌株的菌落直径均表现先升后降的趋势。敏感菌株对低渗透压环境不敏感,对中、高渗透压环境较为敏感;抗性菌株对NaCl低、中渗透压环境均不敏感,只对高渗透压环境敏感。经不同浓度戊唑醇处理后,供试菌株的相对渗透率均随时间增加呈上升趋势,敏感菌株的相对渗透率低于同期的抗性菌株,说明后者的细胞膜通透能力较强,对戊唑醇的排泄能力也较强,而敏感菌株的细胞膜通透能力较差,对戊唑醇反应敏感。试验结果可为花生网斑病菌对戊唑醇抗性机制的研究提供相关依据。     

禾谷丝核菌基因组SSR标记的开发及评价

群体遗传学研究对于了解病原菌的流行、变异及进化规律具有重要意义。但是到目前为止,对小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构的了解并不深入,缺乏有效的SSR标记是主要原因。本研究根据禾谷丝核菌全基因组序列进行了微卫星位点搜索并设计SSR引物,通过电泳筛选和测序验证,最终筛选出12个多态性较好且稳定可靠的SSR标记。利用这些标记对收集自我国安徽、江苏、河南三省的23个禾谷丝核菌菌株进行了多态性分析,结果发现禾谷丝核菌基因组中长片段微卫星位点较少。12对引物扩增出的等位基因数平均为6.1个,期望杂合度平均为0.651,观测杂合度平均为0.508,表明这些标记具有较高的多态性,能够满足禾谷丝核菌群体遗传学研究需要。本研究为进一步进行禾谷丝核菌的多样性、群体遗传结构分析及进化学研究提供了有效工具。     

禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性风险预测

采用菌丝生长速率法,测定了4个麦区的5个禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌株对井冈霉素的抗药性;在含井冈霉素的PDA平板培养基上对禾谷丝核菌进行继代培养,以诱导抗药性菌系;测定了抗性菌系对其他杀菌剂的交互抗性,并比较了抗性和敏感菌系对渗透压的敏感性及药剂处理后两种菌系培养液内还原糖和可溶性蛋白的含量差异。结果表明,田间禾谷丝核菌菌株对井冈霉素分别产生了7.26、7.75、10.46、14.92和23.31倍的抗性。室内继代培养36代,禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性达49.24倍,形成了抗井冈霉素菌系。抗井冈霉素菌系对 口 恶 醚唑、福美双、三唑酮、丙环唑、戊唑醇和咯菌腈分别产生了48.58、21.78、17.62、10.95、2.55和1.78倍的交互抗性。抗性菌系在较低和较高渗透压下其生长抑制率均大于敏感菌系,用井冈霉素处理抗性和敏感菌系后,其体内的电解质都严重外渗,且抗性菌系在10 h 内的外渗量明显大于敏感菌系。     

引起山西省小麦纹枯病的丝核菌融合群鉴定及其对不同杀菌剂的敏感性

为明确引起山西省小麦纹枯病的丝核菌Rhizoctonia种类及其对杀菌剂的敏感性,通过形态学特征观察、rDNA ITS序列分析及致病性测定鉴定分离自23个麦区小麦病样的195株纹枯病菌,并采用菌丝生长速率法测定菌株对氟酰胺、噻呋酰胺和己唑醇的敏感性。结果显示,所有菌株的菌落形态接近于丝核菌,呈双核,可与融合群（anastomosis group,AG）D组各亚群菌株菌丝发生融合反应,但在系统发育树中全部与AG-DI亚群菌株聚为一支,表明195株菌株均为禾谷丝核菌R. ce-realis AG-DI亚群,且经致病性试验验证这些菌株均为山西省小麦纹枯病的病原菌。氟酰胺、噻呋酰胺和己唑醇对菌株的EC₅₀范围分别为0.092~0.610、0.067~0.142和0.008~0.111 μg/mL,均值分别为0.331、0.074和0.052 μg/mL,且菌株对氟酰胺、噻呋酰胺和己唑醇的敏感性频率分布均呈连续的单峰曲线,因此可将以上均值作为山西省小麦纹枯病病原菌禾谷丝核菌AG-DI亚群对氟酰胺、噻呋酰胺和己唑醇的敏感基线。     

禾谷丝核菌环介导等温扩增检测技术体系的建立

为建立简便、快速和灵敏的小麦纹枯病菌——禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis的分子检测技术体系,基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为靶标序列,设计并筛选特异性引物,建立禾谷丝核菌的LAMP检测方法,并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明,基于筛选获得的4条禾谷丝核菌特异性引物建立的LAMP方法能够从15种植物病原菌中特异性地检出禾谷丝核菌,近缘种立枯丝核菌Rhizoctonia solani和引致早期症状易混淆病害的病原菌禾顶囊壳菌Gaeumannomyces graminis、麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum均未检出;该LAMP方法在日光下的灵敏度为10^-1 ng/μL,在蓝光下的灵敏度为10^-3 ng/μL;对发病组织的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦发病组织中...     

戊唑醇对小麦纹枯病菌的抑菌作用

戊唑醇对小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis具有极高的抑菌作用,EC50值仅为0.048 9 μg/mL。经戊唑醇处理后,小麦纹枯病菌除菌体形态发生显著变化外,致病力亦随处理浓度的提高而明显减弱。戊唑醇对小麦纹枯病菌的菌核萌发无抑制作用,但对菌体的线性生长有强烈的抑制活性。菌体经戊唑醇处理后,发生电解质渗漏。     

小麦纹枯病菌的分子检测

小麦茎基部可寄居多种真菌,并可导致发褐、坏死等症状,与小麦纹枯病相混淆.为准确诊断小麦纹枯病,根据江苏省小麦茎基部常见寄居菌禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、长蠕孢菌Helminthosporium spp.、交链孢菌Alternaria spp.、小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var.tritici和禾谷镰刀菌Fsarium graminearum rDNA的ITS区段序列差别,设计合成了2对特异性扩增引物(DNF77 DNR554,DNF81 DNR564)用于小麦纹枯病菌检测.2对引物均能从小麦纹枯病菌株扩增到特异性的分子片段,说明设计的特异性引物可以用来检测小麦纹枯病菌.采集田间具有小麦纹枯病症状、茎基部变褐及健康麦苗,进行病原菌分离,同时提取这些麦苗茎基部DNA,利用上述2对引物进行扩增.结果表明,仅从能分离到禾谷丝核菌的麦组织中扩增到约480bp的特异性条带.说明设计的特异性引物可以对田间小麦纹枯病进行早期、快速分子诊断.     

2%三唑醇·戊唑醇种衣剂对小麦纹枯病菌麦角甾醇含量的影响

分别用三唑醇原粉、戊唑醇原粉和2%三·戊种衣剂(1.2%三唑醇＋0.8%戊唑醇,质量分数)处理小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis后,采用皂化处理样品法提取并用高效液相色谱法测定其体内的麦角甾醇含量。结果表明,随着药剂浓度升高,麦角甾醇的含量逐渐降低,说明药剂浓度越高抑制作用越强。当药剂有效成分浓度为5.0 μg/mL时,7 d后对病菌的抑制率分别为60.4％、63.8％、63.8%。药剂处理浓度相同时,菌丝麦角甾醇的含量高低顺序为:三唑醇处理＞三·戊种衣剂处理＞戊唑醇处理。说明药剂处理菌丝后其体内麦角甾醇的合成受到抑制,从而导致其含量显著降低。     

四地区小麦纹枯病菌对6种杀菌剂的抗性比较

从山东和江苏的4个小麦产区采集分离了5个小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis菌株，为明确小麦纹枯病菌对不同杀菌剂的抗性现状，采用生长速率法测定了5个小麦纹枯病菌菌株对三唑酮、井冈霉素、戊唑醇、咯菌腈、丙环唑、苯醚甲环唑6种常用杀菌剂的抗性。结果表明：江苏镇江菌株（JZ）对三唑酮和井冈霉素的抗性分别高达20．46和23．31倍，山东聊城2个菌株（L1和L2）和泰安菌株（TA）对三唑酮的抗性分别为14．26、10．10和11．98倍，滕州菌株（聊）和泰安菌株（TA）对井冈霉素的抗性分别为14．92和10．46倍。5个菌株对戊唑醇、咯菌腈、丙环唑和苯醚甲环唑抗性均不明显，其中戊唑醇对小麦纹枯病的防治效果最好。     

河南省小麦纹枯病菌及小麦全蚀病菌对丙环唑的敏感性

正小麦纹枯病和小麦全蚀病是河南省小麦生产上重要的土传病害,发病面积分别在300万和30万hm~2~([1,2])。近年来,由于小麦高产栽培措施(早播、密植、高肥)的推广,以及气候条件适宜、农机跨区作业等原因,两种病害的发生面积日益增大,     

中国河南省小麦纹枯病菌对苯醚甲环唑及戊唑醇的敏感性

为明确中国河南省小麦纹枯病菌对苯醚甲环唑及戊唑醇的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了2种药剂对采自河南省15个地市分离的95株病菌的毒力。结果显示:供试菌株对苯醚甲环唑和戊唑醇的EC50值分别在0.014~1.609和0.002~0.064 μg/mL之间。敏感性频率分布图显示:在小麦纹枯病菌群体中已出现对苯醚甲环唑敏感性下降的亚群体,而对戊唑醇则不明显;可将其中呈连续单峰频次分布的大多数菌株群体的平均EC50值（0.165±0.101）和（0.019±0.008）μg/mL分别作为小麦纹枯病菌对苯醚甲环唑和戊唑醇的相对敏感基线。苯醚甲环唑的平均EC50值是戊唑醇的26倍,表明该病原菌对戊唑醇更为敏感。不同地区病原菌群体间对苯醚甲环唑和戊唑醇的敏感性均存在显著性差异。小麦纹枯病菌对2种杀菌剂的敏感性之间存在着微弱的正相关性。本研究结果可为河南省小麦纹枯病防控杀菌剂的合理使用提供理论依据。