青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

生防菌对青枯雷尔氏菌的致弱特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的致病性与弱化指数存在着特定的相关性,弱化指数＜0.60时,菌株回接番茄组织培养苗的发病率为100%,定义为强致病力菌株;弱化指数＞0.80,回接发病率为0,定义为无致病力菌株,弱化指数介于0.60和0.80之间,回接发病率5.3%～100%,菌株的致病性为不确定性,定义为过度性菌株.010703-01菌株进行培养致弱、物理致弱、化学致弱和生物致弱的实验结果表明培养时间延长至120 h未发现致弱作用继代培养11代以前未出现明显致弱;物理因子超声波处理无致弱作用;化学因子农用链霉素处理有抑制作用,但无致弱作用;生物因子15种细菌的致弱作用可用聚类分析将之分为三类,第一类具致弱特性,包括青枯病生防菌ANTI-8098A(Bacillus cereus)和球形芽孢杆菌(B.sphaercus),第二类具抑制特性,而无致弱作用,包括Bt-9408(B.thuringiensis)等3种芽孢杆菌;第三类抑制作用低和无致弱作用,包括阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)和未知学名的10株芽孢杆菌(Bacillus spp.)等.研究结果表明,生防菌对青枯雷尔氏菌的致弱作用与因其它因素产生的致弱作用有着本质区别.     

福建省青枯雷尔氏菌无毒基因组成及与致病力关系分析

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化严重.为了解福建省青枯雷尔雷氏菌的致病力类型及与无毒基因组成关系,本研究以弱化指数为指标,对福建省内不同地区和寄主的63个青枯雷尔氏菌进行致病力测定,结果表明,供试的青枯雷尔氏菌可分为3种致病力类型:强致病力、过渡型和无致病力;进一步对供试菌株进行无毒基因avrA、popP1和popP2的检测,3个无毒基因分布频率不同,avrA基因分布频率最高,达79.37％,popP1基因的分布频率最低为46.03％;不同寄主的菌株无毒基因组成不同,番茄(Lycopersicum esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)寄主以分布3种和2种无毒基因为主,茄子(Solanum melongena)寄主主要分布2种无毒基因,花生(Arachis hypogaea)寄主的菌株无毒基因分布较少,只分布1种avrA基因或没有检测到无毒基因;不同地域的菌株无毒基因组成不同,以番茄寄主为例,建瓯玉山镇的菌株分布3种和2种无毒基因为主,分别占45.45％和31.82％,宁德屏南菌株中3个无毒基因均等分布,福州北峰菌株中只分布avrA和popP2基因,二者均等分布,福州营口菌株中popP2基因分布频率最高,达60.00％;不同致病力的菌株无毒基因组成不同,无致病力菌株分布3种和2种无毒基因为主,过渡型菌株分布2种无毒基因为主,而强致病力菌株分布1种无毒基因为主;青枯雷尔氏菌的无毒基因组成与致病力相关性分析表明,3个无毒基因分布均与致病力呈正相关,其中popP1基因与菌株致病力相关性最高,达显著水平,其皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)值为0.31.本研究为植物青枯病预警和防控提供重要信息.     

基于BOX-PCR和REP-PCR技术青枯雷尔氏菌遗传多样性分析

青枯雷尔氏菌(Ralstonias olanace arum)能够对许多重要作物引起致命性萎蔫病害,广泛分布在热带、亚热带以及温带地区.研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义.本研究利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定84株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌,结果表明,这些菌株均在504 bp位置出现特异性条带.同时采用BOX插入因子PCR(BOX-PCR)和重复基因外回文序列PCR(REP-PCR)对这些菌株进行基因多样性研究,基于它们所扩增出的基因指纹图谱表明,BOX-PCR扩增出19条特异性条带,REP-PCR扩增出20条特异性条带.系统聚类结果表明,青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,其中,寄主植物是在遗传差异中起主导作用.进一步分析可知,地域性的差异主要由BOX-PCR提供,寄主间的差异主要由REP-PCR提供.不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带,在REP-PCR中同样具有与各个寄主相对应的特异性条带,利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌.BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径.     

基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性*

应用ITS序列和RAMS技术对福建省不同地域,不同寄主作物的青枯雷尔氏菌进行遗传多样性研究。结果表明,供试的21株青枯雷尔氏菌的ITS区序列有3种类型,这3种类型菌株的ITS序列只有1-2个碱基的差异,与参比菌株GMI1000的ITS区序列或者相同或者有1-2个碱基的差异。在此基础上,利用RAMS技术进一步分析表明,供试的青枯雷尔氏菌及参比菌株GMI1000的基因组DNA间存在丰富的多态性。聚类结果显示,供试菌株可聚为3个类群,同一寄主作物的菌株聚在同一类群中,同一地理来源的菌株聚在同一亚类群中,说明青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,与寄主作物的关系更密切。     

插入序列ISRso21在青枯雷尔氏菌中的分布以及插入位点多态性分析

插入序列(insertion sequence,IS)元件可以插入到基因或DNA序列,其可能在生物体进化中起着重要的作用。ISRso21是在青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)FJAT-1458菌株中发现的一个新的插入序列。根据序列分析可知,该插入序列是属于ISL3家族中的一个成员。本研究发现,福建闽北地区菌株ISRso21的阳性率高于其他地区的趋势,不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布有显著性差异,ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此,由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同,从而导致青枯雷尔氏菌致病性的差异。研究表明,由于ISRso21的插入导致表现型转换系统转录调控因子A(phc A)的重排可能在青枯雷尔氏菌的致病性起着极其重要的作用。在所有菌株中,ISRso21在phc A基因上游中插入的检出率达到4.71%,其中无致病力菌株和强致病力菌株中的检出率分别为28.57%和0.00%。而ISRso21在二氨基庚二酸脱羧酶基因中的插入可能是为了更好地适应环境。ISRso21在不同致病性青枯雷尔氏菌中的插入位点的研究,可能为揭示青枯雷尔氏菌致病性机制提供新的研究途径。     

生物有机肥对烟草根际微生物群落及青枯雷尔氏菌丰度的影响

【目的】探究生物有机肥施用对烟草根际土壤细菌、真菌群落结构和青枯雷尔氏菌丰度的影响机理。【方法】选用长沙市某公司生产的生物有机肥和常规烟草专用肥,在湘西花垣县长期定位试验点连续5年开展大田试验,研究施肥对土壤理化性质和微生物群落的影响。试验设置两种施肥处理：常规烟草专用肥（CF）和生物有机肥（BOF）。【结果】与CF相比,施用生物有机肥处理的土壤烟草青枯病发病率降低了89.8%,同时青枯雷尔氏菌相对丰度也显著降低,降幅达40.1%;土壤pH、碱解氮和有效磷显著增加,分别增加了1.2%、12.1%和60.2%;施用生物有机肥后根际土壤微生物如Roseiflexaceae,Gemmatimonadaceae,Nitrospira,Ramophialophora,Preussia等显著富集,且这些潜在有益菌与青枯雷尔氏菌相对丰度呈显著负相关关系。通过ABT预测模型分析发现潜在有益菌是影响青枯雷尔氏菌相对丰度的最主要生物因子。【结论】连续5年的试验结果表明,施用生物有机肥不仅改善了作物生长的土壤环境,显著提高了土壤pH和土壤速效养分含量,还促使潜在有益菌在根际土壤中富集,抑制了青枯雷尔氏菌的生...     

瓜类细菌性果斑病菌群体感应信号分子的检测及其对致病性的影响

瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜和甜瓜上危害最为严重的病害之一,目前除了严格的检疫措施之外,尚无十分有效的控制措施。随着细菌群体感应（Quorum sensing,QS）系统的发现和研究进展,利用“信号干扰技术”控制植物细菌病害已经成为研究热点并取得了成功应用。本文利用生物测定技术首次从瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）检测到群体感应信号分子（AHL）,并将能够降解细菌信号分子的aiiA基因转化到瓜类细菌性果斑病菌NJF10菌株中,室内接种试验表明该转化菌株的致病性明显的减弱,证明其对果斑病菌的致病性具有调控作用。研究结果为利用信号干扰技术控制瓜类细菌性果斑病奠定了基础。     

适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究.     

青枯菌II型分泌系统编码基因的克隆

植物青枯菌II型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌II型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,我们通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌II型分泌系统的全部12个gsp基因。分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库。经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达,为GSP蛋白之间的互作研究奠定了基础     

辣椒内生菌拮抗细菌的筛选

从广西一些县市采集辣椒茎标本，经分离得到41个细菌菌株，分属为土壤杆菌(Agrobacterium spp．)、分枝杆菌(Mycobacterium spp．)、微杆菌(Microbacterium spp．)、欧文氏菌(Eruinia spp．)和芽孢杆菌(Bacillus spp．)，其中芽孢杆菌(Bacillus spp．)为优势种群。用抑菌圈法测定对茄青枯病菌有拮抗作用的有3个菌株，用浸种法和注射法测定具内生性的有17个菌株，具内生性同时又具拮抗作用的有2个菌株。     

Suppression of Ralstonia solanacearum in soil following colonization by other strains of R. solanacearum

The effect of prior colonization of a sterile loam soil and a sterile clay loam soil by individual soil bacteria on the subsequent growth of a bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum YU1Rif43 (tRNA type III: Seal et al. 1992: Appl. Environ. Microbiol., 58, 3759–3761) was investigated. Various strains, belonging to the same type, the same species, the same genus, Gram-negative, Grampositive, or fungi, were used. The degree of suppression of the growth of R. solanacearum YU1Rif43 was markedly different depending on the species that had previously colonized the soil, hereafter referred to as priorcolonists. All the strains belonging to R. solanacearum type III suppressed the growth of R. solanacearum YU1Rif43 markedly, while strains of R. solanacearum type I and type II showed a moderate suppressive effect on R. solanacearum YU1Rif43. The suppressive effect of the strains belonging to species other than R. solanacearum, including fungal strains, was relatively limited, or some strains did not show any suppressive effect. The production of bacteriocin did not appear to be related to the strong suppressive effect of the R. solanacearum type III strains. Possible mechanisms for the suppressive effect of priorcolonists on R. solanacearum YU1Rif43 are discussed in relation to nutrients and physical sites in soil available for growth.