根癌农杆菌介导BDN1 基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种东农303 微型薯为试验材料,通过根癌农杆菌介导法,将来自耐旱植物厚 叶旋
蒴苣苔的脱水蛋白基因BDN1 导入马铃 薯,并对其遗传转化的影响因素进行了研究。获得了抗性再生植株
35 株 ;PCR 检测27 株呈阳性;Southern-blot 检测4 株呈阳性,表明BDN1 基因已整合到马铃薯基因组中;
半定量RT-PCR 检测结果表明BDN1 基因在马铃薯抗性植株中表 达。通过对相对含水量、脯氨酸、丙二醛
含量和SOD 活性测定,证明4 个转基因株系对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。     

沙田柚遗传转化的探讨

采用含ｎｏｓ基因和人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因ＡＰ－Ｄ基因的根癌农杆菌对沙田柚外植体进行转基因研究,与根癌农杆菌共培养产生的芽,苗经Ｋｍ敏感性筛选,获得了若干转基因植株,并对这些植株进行了报告基因ｎｏｓ表达的电泳检测,同位素标记、ＡＰ－Ｄ基因为探针的点印迹杂交,外源ＡＰ－Ｄ基因的ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交。结果显示,报告基因ｎｏｓ、抗菌肽Ｄ基因已转入沙田柚植株细胞中。     

农杆菌介导的BnCS基因对黄瓜遗传转化研究

以黄瓜为受体,用农杆菌介导的方法,将同源克隆的抗冷基因BnCS转入黄瓜,建立农杆菌介导的遗传转化体系,获得转化的抗性植株;对抗性植株和后代进行PCR鉴定,证明BnCS基因已经转入黄瓜.对T0种子和T1植株进行耐冷性鉴定.结果表明:后代耐冷性有所增强;试验获得的耐冷材料已应用于育种中.     

根癌农杆菌介导的韭菜基因转化体系的建立

 以GUS 基因为报告基因, 建立了农杆菌介导的韭菜基因转化体系。研究结果表明, 以预培养4～6 d 的根尖为转化受体, 用OD₆₀₀0. 6 ～0. 8 的LBA4404 浸染2～5 min , 共培养2 d , 然后在MS + NAA1 mg/L + BA 2 mg/L + Km 25 mg/L + Timentin 400 mg/L + As 100 mg/L 培养基上培养40 d , 后有愈伤组织产生,转入光下培养20 d 后有少量绿色不定芽产生。经X-Gluc 染色、PCR 分析和Southern blot 检验, GUS 基因已经整合到韭菜基因组染色体上。     

农杆菌介导P2300-pa-8e抗虫基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种早大白和克新18号微型薯为外植体,利用根癌农杆菌介导法,将来源于Bt菌株Bt185的P2300-pa-8e抗虫基因转入马铃薯,并对其遗传转化的影响因素进行研究。获得抗性植株早大白19株、克新18号21株|经PCR检测,5株早大白、9株克新18号呈阳性|经Southern-blot杂交分析,4株早大白、6株克新18号呈阳性,证明P2300-pa-8e基因已整合到马铃薯基因组中。在网室内对转基因植株进行抗虫试验,转基因材料对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟幼虫表现出抗性。     

农杆菌介导的CBF1基因对松南结缕草的遗传转化

CBF1（C-repeat/dehydration-responsive element binding factors 1）基因为来源于拟南芥的一类与干旱、高盐及低温耐性有关的转录因子基因。松南结缕草（Zoysia sp.）是本实验室育成的形态特征介于日本结缕草与沟叶结缕草之间的一种中型结缕划，在长江以南地区广泛种植。     

野生型农杆菌Ti和Ri质粒对马铃薯的双转化研究

用不同的野生型根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T37，B6，TFA16YE和发根农杆菌（Agrobacteriu．rhizogenes）TR105，15834，A4对马铃薯普通栽培种品种“甘农薯1号”的块茎圆片、茎段采用两步侵染法和一步侵染法进行了双转化实验。结果表明：两步侵染法效果较好，并得到了分化苗。试验证明，Ti和Ri质粒上的T-DNA可进入同一个受体细胞并进行表达，2种T-DNA上的不同激素在受体细胞中表达可以使受体细胞建立新的激素平衡，从而提高了转化细胞分化苗的能力，可以克服野生型农杆菌难以分化苗的缺点，为今后用野生型质粒作载体以及同时向一个受体细胞中转移多个基因打下了基础；此外不同菌种组合的效果不同，分化植株的形态差异也很大；试验还发现，T-DNA在整合到受体细胞染色体上时，可以引起某些基因发生突变。因此，今后只要用双转化法能使野生型农杆菌双转化的细胞分化出正常植株，则野生型农杆菌就可以作为一种重要的诱变源为育种提供较多的变异。     

植物基因转化方法的研究概况

综述了目前用来进行植物基因转化的各种方法及其优缺点 ,以期为植物转基因方法的选择提供借鉴     

樱桃砧木叶片再生系统建立及抗菌肽基因转化

 以优良樱桃砧木新品系98-1、Colt、大青叶为试材进行叶片离体再生及根癌农杆菌介导遗传转化，建立了高频率再生系统，并获得抗菌肽转基因植株。诱导叶片再生的最佳培养基为MS附加BA 1.0—2.0 mg/L、NAA 0.3—0.5 mg/L、GA 0.5 mg/L、AgNO3 5.0—10.0 mg/L。农杆菌及受体感受态是影响转化的关键，延迟筛选可提高叶片中转化细胞对卡那霉素的抗性而利于再生。PCR及Southern Blot检测为阳性，表明抗菌肽基因已整合到樱桃砧木98.1基因组。     

康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究

 在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上，用花特异表达启动子驱动的康乃馨ACC氧化酶反义基因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转化，获得了3株转基因植株．经多重PCR及PCR-Southem杂交检测，证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨的基因组中。     

根癌农杆菌介导Cry1Ac基因转化‘雪青’梨获得转基因植株

 以‘雪青’梨叶片愈伤组织为外植体, 经根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的Cry1Ac基因导入‘雪青’梨。698块愈伤组织和231个Kan^r芽与携带表达载体质粒pBX203的根癌农杆菌菌株LBA4404共培养3 d后, 转入含50 mg·L^-1 Kan的筛选培养基培养30 d, 15 d转接1次。结果表明,在MS + 5 mg·L ^-1 6-BA + 0.1 mg·L^-1 IAA筛选培养基中, Kan^r芽率为34.24% , 在1/2MS + 2 mg·L^-1 IBA+ 0.5 mg·L^-1 6-BA + 500 mg·L^-1AC筛选培养基中, 15.58% Kan^r芽生根。共获得再生植株32株, 经PCR和Southern-blot分析证明, 其中4株的基因组已成功导入和整合Cry1Ac基因。     

番茄无选择标记转化体系的研究

以含多毛番茄GGPS 基因的表达载体pBI121-GGPS 和无标记载体pBINMF-GUS 为基础,利用载体pBINMF-GUS 的T-DNA 区无选择标记基因的特点,将目的基因GGPS 连接于pBINMF-GUS 的T-DNA 中,用农杆菌菌株EHA105、C58 介导转化番茄品种中蔬6 号,利用PCR 直接筛选转化体。结果表明：MS+1.0 mg·L^-1 ZT+0.5 mg·L^-1 IAA 为子叶最佳芽诱导培养基,农杆菌菌株EHA105 更利于中蔬6号的转化,获得阳性植株4 株,转化率为3.6%。PCR 及RT-PCR 检测结果表明：目的基因已整合到中蔬6 号基因组中,且在转录水平上得到表达。     

根癌农杆菌介导荔枝遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因(uidA)的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导荔枝胚性愈伤组织遗传转化的若干因素。结果表明:在AGL-1、LBA4404和EHA105三种菌株中,EHA105对荔枝胚性愈伤组织的侵染力最强;采用2d的共培养时间既有较高的瞬时表达率,又避免了农杆菌的过度生长;0.5×10~8个细胞/mL的菌液密度为最佳侵染浓度;继代培养15d的胚性愈伤组织处于最旺盛分裂的时期,是转化的合适受体;愈伤组织转化前干燥处理对uidA瞬时表达率的提高有一定的促进作用。使用优化的农杆菌侵染条件获得了稳定表达uidA基因的荔枝抗性愈伤组织。     

CsFAD7基因转化烟草的研究

以革新一号烟草种子为试材,采用根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法将来源于黄瓜的脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)转入烟草,并在附加300mg/L氨苄青霉素(Amp)的MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA的培养基上诱导植株分化,再生芽在附加300mg/L Amp和100mg/L卡那霉素(Kan)的MS培养基上生根,获得再生植株。结果表明:Kan阳性植株经PCR检测筛选,得到转基因阳性植株,证明异源FAD基因已转入烟草基因组中。T1代经PCR-South-ern检测证明转化基因可以遗传;转基因烟草在低温胁迫下生长较好,叶绿素荧光参数F0值下降不大,Fv/Fm值保持较高,表现了对低温的耐受能力,脂肪酸分析表明,该基因可以使烟草叶片的亚麻酸含量比例升高。     

紫红线茄转基因体系的优化及基因SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化

建立了以紫红线茄下胚轴为外植体的高效转基因体系。利用该方法,以获得茄子SmARF8基因RNA干涉转基因植株为目的,构建了以NPTⅡ基因为筛选标记的融合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT,并通过农杆菌介导,侵染茄子下胚轴外植体。含有2 mg · L^-1吲哚乙酸,0.5 mg · L^-1玉米素,25 mg · L^-1卡那霉素和500 mg · L^-1头孢氨苄的MS选择培养基可直接诱导外植体产生转基因分化苗,再生率达到80%。转基因苗继续生长并在不含激素的MS培养基上产生健壮根系,最终获得转基因株系。RT-PCR和qRT-PCR分析验证了T₀代转基因株系中内源基因SmARF8被干涉后不表达或表达量降低,Southern blot分析显示选择的T₀代转基因株系中存在1个T-DNA插入拷贝。以上研究结果表明利用建立的转基因体系SmARF8基因在茄子中被成功敲除。     

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的若干因素。结果表 明:西瓜子叶块外植体对潮霉素较为敏感,15 mg/L是适宜的筛选浓度,可明显抑制非转化组织的生长;脱菌过程中 采用500 mg/L的头孢霉素,对外植体生长影响较小;农杆菌菌株EHA105对西瓜子叶块的侵染能力较强;预培养有 利于转化;共培养3-4 d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600值为0.3的菌液侵染10min效果最 佳;共培养培养基中添加乙酰丁香酮可提高转化频率。     

马铃薯Desiree遗传转化体系的优化及转基因植株的获得

为优化马铃薯品种Desiree的遗传转化体系并获得转基因马铃薯,以Desiree叶片和茎段为外植体,分别比较了不同转化条件（预培养时间、菌液浓度、侵染时间及激素配比）对遗传转化效率的影响。结果表明：以茎段为外植体,预培养2 d后以OD600=0.5的菌液侵染10 min,在加有1.0 mg?L-1反式玉米素（ZT-t）的MS20选择培养基上的遗传转化率最高,其愈伤诱导率可达80 %,芽分化率可达70 %。通过该转化体系将抗晚疫病基因R1导入马铃薯,获得了具有卡那霉素抗性的转化植株。经PCR检测和抗病接种鉴定,外源基因已经导入马铃薯基因组中,获得的转基因马铃薯具有很强的抗晚疫病能力,且转基因马铃薯植株和块茎的重要农艺性状没有发生改变。