应用聚合酶链反应快速检测试验猴沙门氏菌和志贺氏菌

根据Genebank提供的沙门氏菌invA基因序列和志贺氏菌ipaH基因序列设计引物,分别建立了检测2种致病菌的PCR方法。应用于检测临床试验猴粪便样品85份,检出沙门氏菌阳性3份,志贺氏菌阳性9份,阳性检出率分别为3.5%和10.6%。试验证明建立的沙门氏菌和志贺氏菌PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于试验猴临床粪便样品的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究

[目的]利用环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌。[方法]以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）作为靶序列,设计引物,优化Mg2＋浓度、Bst酶浓度等反应条件,建立LAMP反应体系。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的适宜反应条件;该法检测志贺氏菌的灵敏度为62 cfu/ml。[结论]该研究初步建立了一种利用LAMP快速检测志贺氏菌的方法,为食品中志贺氏菌快速检测构建了一个技术平台。     

志贺菌分子生物学检测方法研究现状

志贺氏菌又称痢疾杆菌,是细菌性痢疾的病原菌。多年来,志贺氏菌引起的鸡腹泻对养鸡经济效益的影响很大,已引起高度重视。着重介绍了志贺氏菌分子生物学检测方法的研究现状,为临床诊断治疗志贺氏菌引起的腹泻病提供可靠依据。     

志贺氏菌RAPD鉴定方法的建立

[目的]为志贺氏菌食源性疾病的流行病学溯源和疫情控制提供理论依据。[方法]利用5个随机引物对4种不同来源的志贺氏菌进行RAPD扩增,并对得到的扩增图谱进行聚类分析。[结果]5个随机引物中,引物S3、S5表现出较好的多态性。在引物S5的扩增图谱中,志贺氏菌属中各菌均有1条600 bp左右和1条1 000 bp左右的共同谱带,而利用该引物扩增其他属细菌,扩增谱带很少或没有。这说明引物S5对志贺氏菌属细菌是特异性的。根据引物5的聚类分析结果,可将8株志贺氏菌分成4个类群。除宋内氏志贺氏菌外,其他3种6株菌间的相似系数均为1.00,与传统的血清型分型结果完全一致。[结论]采用引物S5的RAPD反应可用于志贺氏菌的快速检测。     

志贺氏菌噬菌体ΦDS8对患病肉鸡的治疗及其肠道菌群的影响

志贺氏菌是一种常见的肠道致病菌,其引起的细菌病是危害公共卫生的人畜共患病之一。随着抗生素的滥用,志贺氏菌耐药性的问题难以控制,急需新的方法来解决,采用噬菌体杀灭耐药性细菌已日益受到重视。本研究建立肉鸡感染志贺氏菌模型,分别采用感染前2 h灌喂噬菌体液预防和感染2 h后灌喂噬菌体液两种方法对肉鸡进行治疗。灌喂志贺氏菌2 h后的肉鸡均出现腹泻状况,粪便中志贺氏菌含量最高达到1×10⁷ CFU·g^-1,优势菌群含量大幅下降,有害菌群占比上升。噬菌体治疗后,肉鸡粪便中噬菌体含量上升,志贺氏菌含量下降,粪便性状及肠道菌群恢复正常,且肉鸡存活率100%。没有噬菌体治疗的肉鸡存活率60%,解剖观察发现器官病变明显。噬菌体ΦDS8在治疗志贺氏菌株感染方面有良好的效果,其作为抗生素替代产品有较好的应用价值和前景。     

志贺氏菌病发病机制的研究进展

志贺氏菌也称痢疾杆菌,属于革兰氏阴性细胞内致病菌,主要侵害结肠,引发炎症并形成溃疡,可引起频繁的粘液性血性腹泻,儿童和幼龄动物有较高的感染率和死亡率.目前志贺氏菌病的临床治疗很困难,对志贺氏菌病发病机制的研究可为临床治疗提供理论依据,本文从志贺氏菌的胞内入侵机制、分子机制和免疫机制等方面概述志贺氏菌病发病机制的研究进展.     

茄科雷尔氏菌IMSA-LAMP检测方法的建立

【目的】桑树青枯病是由茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的一种危害严重的细菌性病害，建立一种快速、灵敏的茄科雷尔氏菌检测方法，对桑树青枯病的有效控制有重要意义。【方法】本研究以茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因（Pectate lyase gene）为靶标，基于等温多自配引发扩增技术（Isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA）的引物设计原理，结合环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）的反应体系，建立一种快速有效检测茄科雷尔氏菌的IMSA-LAMP法，并对该方法的最佳反应参数进行了筛选。【结果】基于果胶裂解酶基因建立的IMSA-LAMP检测方法在64.5℃条件下，45 min内可完成对阳性样品的特异检测，对茄科雷尔氏菌的模板DNA检测灵敏度达200 fg/μL （对应菌为1×10²CFU/mL）；对生产上收集的疑似桑树青枯病病样的检出率为87.5%。【结论】IMSA-LAMP检测方法具有良好的实用...     

冷藏对虾中腐败希瓦氏菌活菌EMA-qPCR检测方法的建立

【目的】将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光PCR技术相结合,建立快速检测腐败希瓦氏菌活菌的方法。【方法】用不同浓度的EMA和作用时间优化对腐败希瓦氏菌活菌的EMA-qPCR检测方法。研究该方法对活菌的最低检出限及能抑制死菌DNA扩增的最高浓度。研究该检测方法对不同比例死、活腐败希瓦氏菌的检测效果。用10株不同细菌验证该方法的特异性。检测101尾冷藏南美对虾中的腐败希瓦氏菌,并用平板培养法和qPCR方法对结果进行验证。【结果】EMA-qPCR检测最优方法为用终浓度20μg/mL的EMA处理细菌20 min。建立的EMA-qPCR法能够最低检测活菌的浓度为1 CFU/反应,能有效抑制1.0×10~7CFU/反应腐败希瓦氏菌死菌细胞DNA的扩增。对于死活混合菌,EMA-qPCR能够选择性扩增活菌DNA。该检测方法特异性良好。EMA-qPCR、平板培养和qPCR分别在16、12和19尾对虾中检测到腐败希瓦氏菌。【结论】EMA-qPCR检测技术能够快速、准确的区分腐败希瓦氏菌死菌和活菌,可作为水产品中腐败希瓦氏菌活菌的新检测方法。     

食蟹猴肠道志贺氏菌的分离和鉴定

[目的]为志贺氏菌流行病学的调查和相关疾病的防治提供依据。[方法]从2~3岁的健康食蟹猴的230份新鲜粪便样品中分离可疑菌株,并对分离到的菌株进行氧化酶实验、血清型分型和生化实验。[结果]从230份食蟹猴新鲜粪便样品中分离出3株可疑菌株,阳性检出率为1.3%。通过形态学观察、生化实验和血清学检测,3株可疑菌株均被鉴定为志贺氏菌B群,其中2株血清型为2α型,1株血清型为Y变种,属于主要流行菌群。3株可疑菌株的生化反应结果符合志贺氏菌的生化反应特点。[结论]该研究可保证出口试验猴无感染志贺氏菌的要求。     

实验猴志贺氏菌检出、血清分型及药物敏感性试验

采用实验动物国家标准(GB/T 14926.47-2001)的检验方法,对144份待出口实验猴粪便样品检测,检出志贺氏菌2株,阳性检出率1.39%。血清学分型,均属于B群志贺氏菌,血清型分别为X变种和Y变种。药敏试验结果表明,2株分离菌对先锋V、氟哌酸和环丙沙星高度敏感,而对青霉素、红霉素和复方新诺明耐药。     

Taqman三重实时PCR快速检测原料乳中致泻性大肠埃希氏菌

建立可对原料乳中致泻性大肠埃希氏菌(包括肠致病性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌和肠产毒性大肠埃希氏菌)同时进行快速检测的Taqman三重实时PCR方法。以致病菌中常见的eae、ipaH和lt基因为目的片段,选择3种特异性引物和Taqman探针进行三重实时PCR扩增,研究反应的特异性、检测限和重复性,并用所建立的方法对38份原料乳进行检测。结果表明,扩增曲线形态良好,对原料乳中其他常见致病菌无交叉反应,对含致病菌为1 cfu.mL-1的乳样经2 h增菌处理后检测结果呈阳性,对原料乳样重复性检测的CV值均小于5%。完成全部检测过程只需大约6 h。该方法快速准确,可应用于原料乳中致泻性大肠埃希氏菌的快速检测和污染调查。     

重组酶介导等温扩增技术检测鰤鱼诺卡氏菌方法的建立

为建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification, RAA)的快速检测鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的方法,针对鰤鱼诺卡氏菌的特异性基因组片段,设计重组酶介导扩增引物,通过检测7株鰤鱼诺卡氏菌近缘菌和9种水产养殖过程中常见病原菌,筛选出特异性RAA检测引物,并通过将含有目的片段的重组质粒进行梯度稀释以分析该检测方法的灵敏度,最后采用RAA方法检测患病鱼、健康鱼及11种不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株,以评价该检测方法的应用性和覆盖度。结果表明：本研究中设计的引物仅针对鰤鱼诺卡氏菌可以扩增出目的条带,检测灵敏度为100 pg/μL,人工感染鰤鱼诺卡氏菌的杂交鳢(Channa maculate♀×C.argus♂)肝脏、体肾和脾脏等组织基因组DNA能够扩增出阳性条带,不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株可以扩增出阳性条带。研究表明,本研究中所建立的鰤鱼诺卡氏菌重组酶介导等温检测方法具有准确、简便的特点,可对鰤鱼诺卡氏菌进行快速检测。     

人源志贺氏菌对雏鸡的人工感染试验

为了弄清人源志贺氏菌是否可以传播给鸡,从而为志贺氏菌在人-禽传播中的可能性提供科学依据,用不同剂量的鸡源鲍氏志贺氏菌、人源鲍氏志贺氏菌和人源福氏志贺氏菌通过腹腔注射人工感染雏鸡。结果发现,各试验组雏鸡均有不同程度的病变发生,甚至出现死亡病例,且从雏鸡体内分别回收到原接种的3株细菌。这说明了鸡源志贺氏菌的可能来源及有发生人鸡互传的可能性。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。     

鸡源鲍氏志贺菌的RAPD分析

【目的】确定鸡源鲍氏志贺菌的进化地位。【方法】选用6条随机引物(P1~P6),采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对1株鸡源鲍氏志贺菌、2株鸡白痢沙门菌、2株鸡肠致病性大肠杆菌和2株痢疾志贺菌共7株菌的基因组DNA进行分析,同时对个别特殊序列进行克隆测序,并在此基础上分析了鸡源鲍氏志贺菌与其他15个相关菌株的进化关系。【结果】6条随机引物中有4条引物(P1,P2,P4和P6)能较好地在志贺菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡致病性大肠杆菌3种菌中检测到多态性分子标记;这4条有效引物共扩增出了64个DNA片段,其中7个菌株共有的谱带有3条,多态性片段有61条,多态率达95.3%。引物P2可根据扩增图谱将志贺菌和大肠杆菌与沙门菌鉴别出来;用引物P6对上述7株细菌进行扩增,发现同种菌株间谱带特别相似,其中鸡鲍氏志贺菌与人痢疾志贺菌扩增条带的相同率达66.7%,与鸡肠致病性大肠杆菌扩增条带的相同率达44.4%,而鸡白痢沙门菌与志贺菌的扩增谱带相差甚远,可用于3种细菌的鉴别。对扩增片段进行的测序及进化分析结果显示,鸡源鲍氏志贺菌与人源志贺菌的进化距离最近。【结论】鸡源鲍氏志贺菌可能是人源志贺菌的一个变异株或新的亚种。     

太白蓼多糖的硫酸化修饰及其体外抑菌活性分析

建立并优选太白蓼多糖(Polygonum taipaishanease Kung polysaccharide,PTKP)硫酸化修饰的条件,探讨硫酸化修饰对太白蓼多糖抑菌活性的影响。以硫酸根取代度为指标,采用氯磺酸-吡啶法对太白蓼多糖进行修饰,以氯磺酸-吡啶比、反应时间和反应温度为因素水平,采用L9(34)正交试验对修饰条件进行优选。用氯化钡-明胶浊度法测定修饰产物的硫酸基取代度(DS),傅里叶红外变幻光谱法测其结构,微量法测定硫酸化太白蓼多糖(sulfated Polygonum taipaishanease Kung polysaccharide,sPTKP)对大肠杆菌和志贺氏菌的最小杀菌浓度。太白蓼多糖硫酸化修饰的最佳条件为氯磺酸与吡啶体积比为1∶10,反应温度为80℃,反应时间为1h,sPTKP的硫酸基取代度为1.57。红外光谱检测到S=O的伸缩振动峰。PTKP和sPTKP对大肠杆菌和志贺氏菌均有抑制作用,它们对志贺氏菌的抑制作用优于大肠杆菌。硫酸化修饰能提高太白蓼多糖对大肠杆菌和志贺氏菌的体外抑菌活性。     

基于16S rRNA基因的食源性致病菌实时荧光定量PCR检测研究

本研究以16S rRNA基因作为靶基因,利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)三种主要食源性致病菌的多重实时荧光定量PCR检测技术。结果表明,建立的荧光定量PCR检测体系特异性良好、灵敏度高、简便快捷,大大缩短了检测时间,在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。     

狐阴道加德纳氏菌PCR诊断方法的建立与应用

【目的】建立快速检测狐阴道加德纳氏菌的PCR诊断方法。【方法】根据阴道加德纳氏菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物,以分离的狐阴道加德纳氏菌菌体DNA为模板进行PCR扩增,建立狐阴道加德纳氏菌的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及其可行性进行检验。【结果】特异性试验结果表明,狐阴道加德纳氏菌能扩增出437 bp的特异性核酸片段,而大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500 mL-1。利用建立的PCR检测方法,对9株从山东省不同地区分离的疑似狐阴道加德纳氏菌菌株进行检测,结果有4株为阳性。【结论】研究建立的狐阴道加德纳氏菌PCR快速诊断方法,敏感性高、特异性强,可1次检测多个样品。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。选取hlyA基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为46个细菌。用该方法对36份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。