山羊卵母细胞的体外成熟和受精

在有颗粒细胞，促卵泡素，促黄体素及１７β雌二醇存在的情况下，裹着卵泡卵丘细胞的山羊卵母细胞的体外成熟。从直径２－６ｍｍ的卵泡中获得的卵母细胞，有８６％成熟分裂；而直径为１－２ｍｍ的留言簿包，只有２４％的卵母细胞达到中期Ⅱ。卵泡卵丘母细胞复合体，培养前在２０℃下处理，结果有１１．５％的卵母细胞出现不正常的减数分裂的纺缍体。     

山羊卵母细胞体外成熟体系研究进展

卵母细胞体外成熟(IVM)是山羊胚胎体外生产的关键步骤,其对山羊体外生产胚胎的数量和质量均具有非常重要的意义。此外,IVM还可以满足胚胎工程技术如体细胞核移植、转基因动物生产对卵母细胞的大量需求。然而,由于山羊卵母细胞体外成熟研究起步较晚,与牛、猪等家畜相比仍然存在不小的差距,存在诸如体外成熟率低、胚胎质量不佳、培养体系可重复性低等问题。因此,分析山羊卵母细胞体外成熟的主要影响因素,提高山羊卵母细胞体外成熟率,建立山羊卵母细胞体外成熟稳定培养体系,就成为了近年来山羊胚胎体外生产的研究重点。论文综合国内外学者近年的相关研究,对可能影响山羊卵母细胞体外成熟效率的各种因素进行了综述分析,同时对山羊卵母细胞体外成熟现存问题进行了分析,以期为建立山羊卵母细胞体外成熟体系提供理论支持。     

影响山羊卵母细胞体外成熟的因素

就影响山羊卵母细胞体外成熟的主要因素,如卵母细胞的来源、成熟液系统和成熟时间等进行概述。     

羔山羊卵巢卵母细胞体外成熟培养条件的研究

将出生后５０～７０日龄的羔山羊，经超数排卵处理以后，从卵泡中抽取卵母细胞，取外观形态正常的卵母细胞分成五组，在含有１０％胎牛血清（ＦＣＳ）的ＴＣＭ－１９９培养液中分别经１２、１６、１８、２０和２４ｈ的体外成熟培养后进行体外受精，探索不同体外成熟培养时间对体外受精及卵裂率的影响。另外，在成熟用培养基内还分别添加了发情母羊血清（ＥＮＧＳ）和ＦＣＳ以观察其培养效果。结果表明，经过１２～２４ｈ体外成熟培养的卵母细胞，在体外受精后的４８ｈ检查卵裂率分别为１０％、３７．１％、５０．０％，４１．２％和２５．０％，卵母细胞经体外成熟培养１６～２０ｈ的卵裂率显著高于１２ｈ和２４ｈ的卵裂率。在成熟培养基内分别添加ＥＮＧＳ和ＦＣＳ，其体外受精卵的卵裂率分别为６０．３和４６．８％，卵裂率在添加两种血清的培养基之间无显著差异。     

猪卵巢卵母细胞体外成熟研究

细胞经过一系列的生长发育最终形成有受精能力的成熟卵母细胞的过程。IVM技术是随着上世纪动物胚胎体外生产 (IVP)技术的产生和发展而兴旺起来的。利用卵母细胞IVM技术已经先后在牛(1982 )、绵羊 (1985 )、山羊 (1985 )和猪 (1989)上获得试管后代[13] 。现在世界上日本、美国、英国、丹麦、新西兰和澳大利亚等许多发达国家都已成立了专门的动物胚胎体外生产公司。我国IVM的研究起步较晚 ,但发展迅速 ,已先后在小鼠 (1986 )、人 (1985 )、绵羊 (1989)、牛 (1989)、猪 (1990 )上获得了IVP后代[2 ] 。尤其在牛的IVM -IVP的研究上已接…     

屠宰绵羊卵巢卵母细胞的体外培养

为了使屠宰绵羊卵巢卵母细胞能够用于体外受精,本文着重探索了使卵巢卵母细胞体外培养成熟的方法和条件。实验结果表明,以TCM-199加10％FCS作为基本培养基,培养24～25小时,可以使绵羊卵巢卵母细胞培养成熟,其成熟率可达55.5％(435/784)。如果在培养液内添加hCG(0.02mg/ml)或LH(0.01mg/ml),并且尽可能保持卵丘细胞的完整,则可以使成熟率提高到76.9％(140/182)～82.9％(112/135)。     

山羊卵母细胞体外成熟的研究

在38℃和39℃不同温度条件下培养山羊卵母细胞,结果表明:在38℃和39℃下成熟率分别为63.6%和57.3%,二者之间差异不显著,说明只要培养温度在山羊正常体温的变动范围内,对其卵母细胞的成熟率没有影响;在38℃温度条件下用10?S的M199培养液成熟率为62.5%,而10 mg/ml BSA的M199培养液成熟率为58.7%,二者之间差异不显著,说明无血清培养可以代替血清培养.     

不同培养时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响

在体外受精过程中,山羊卵巢卵母细胞体外成熟情况在很大程度上决定着卵母细胞的体外受精率和胚胎发育率.影响卵母细胞成熟的因素很多,主要包括卵泡大小、培养基、激素、培养时间等.试验对不同培养时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响进行探讨,现报道如下.     

山羊卵母细胞体外成熟培养液体积筛选

研究在一定卵丘-卵母细胞复合体(COCs)与培养液体积比例条件下,不同体积的培养液对山羊卵母细胞体外成熟的影响。按照COCs 1枚/4μL培养液的比例,采用5种不同体积的培养液,即50,100,250,500和1 000μL,对山羊卵母细胞进行体外成熟培养和孤雌激活。结果:100μL和250μL两组的卵母细胞体外成熟培养24 h后,其卵母细胞成熟率分别为78.10%和74.62%,差异不显著(P>0.05),但高于50μL组(P<0.05)、500μL组(P<0.05)和1 000μL组(P<0.01)组。100μL组孤雌激活胚胎的卵裂率(68.37%)、桑葚胚率(48.78%)和囊胚率(27.61%)都优于其他各组,其卵裂率和囊胚率与250μL组相比差异不显著(P>0.05)。结果表明采用COCs 1枚/4μL培养液的比例条件下培养卵母细胞,宜选用100～250μL范围内的培养液体积进行卵母细胞成熟培养,其卵母细胞体外成熟率可以达到78.10%左右。     

不同繁殖季节山羊卵母细胞体外成熟及受精效果研究

本试验在2012年11月至2013年5月间进行,笔者从荣昌屠宰场采集了重庆本地黑山羊的卵巢,对于非繁殖季节（冬）和繁殖季节（春）期的卵巢卵母细胞的回收情况作了比较,并观察了不同级别卵母细胞的体外成熟和体外受精情况.结果表明：繁殖季节的卵巢平均回收COCs数、可用COCs数和COCs可用率分别为5.43枚、2.65枚、48.57％,均较非繁殖季节高（P＜0.05）;A、B、C、D级卵母细胞体外成熟率的差异极显著（P＜0.01）,但A、B、C级卵母细胞体外成熟（IVM）卵的体外受精率、卵裂率无显著性差异（P＞0.05）.     

牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立

研究不同犊牛血清浓度、培养时间和不同类型血清对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,添加体积分数为10%,15%和20%的FBS时,各组间卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养时间为16h时卵母细胞成熟率与培养时间为20h和24h时的差异极显著(p<0.01),而培养时间为20h和24h时卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养基添加OCS对卵母细胞成熟的影响效果与添加FBS的无显著差异(p>0.05),二者的卵母细胞的核成熟率均达到80%以上。     

超排山羊卵巢卵母细胞体外成熟和体外受精的研究

以ＴＣＭ１９９＋１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ＋青霉素（６ｍｇ／Ｌ）＋链霉素（５ｍｇ／Ｌ）为基础培养液（ＢＭ），再分别加入不同成分，配成５种卵母细胞成熟液：（Ａ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ；（Ｂ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ＋ＨＣＧ（２．５ｍｇ／Ｌ）；（Ｃ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ＋ＨＣＧ＋Ｅ２（１ｍｇ／Ｌ）；（Ｄ）ＢＭ＋１０％ＦＣＳ＋ＨＣＧ＋Ｅ２；（Ｅ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ＋ＨＣＧ＋Ｅ２＋颗粒细胞（１．５×１０６～３．０×１０６个／ｍＬ）。在３８．５℃、５％ＣＯ２下培养２６ｈ，排卵后第１天卵巢卵母细胞体外成熟率分别为６７．６７％（２０／３０），６０．４２％（２９／４８），８３．６７％（４１／４９）和８０．８２％（５９／７３），排卵后第５天卵巢卵母细胞，在培液Ｄ中体外成熟率为７１．４３％（４５／６３）。排卵后第１天的９８枚卵巢卵母细胞，体外成熟体外受精卵裂率为２１．４３％，２１枚２细胞胚移植５头受体获２头羔羊。研究表明，超排山羊卵巢卵母细胞经体外成熟可获得大量廉价的成熟卵母细胞，并可通过体外受精获得试管山羊     

山羊腔前卵泡卵母细胞体外发育与体外成熟的研究

通过比较3种培养基、5个培养系统和4种培养方法对卵母细胞生长率的影响,结果发现,就卵母细胞生长率而言。以MEM HEPES培养液＋5％FCS＋40μg/mlFSH 20ng/ml IGF-1 2mmol/L cAMP 2mmol/L次黄嘌呤培养系统为佳。在腔前卵泡体外培养过程中,12个卵泡经腔期发育,约占同等培养条件下卵泡九的2％（12／603）。培养卵泡经腔期发育并未改善其卵母细胞的成熟率（0／12）。腔前卵泡卵母细胞经过不同时间的体外培养,发现经12和14d培养结不的卵母细胞中,有81％（47／58）生发泡明显迁移至质膜下;培养14d的卵母细胞中,约16．4％（9／55）产生pbI但不排出,因而在胞质中见到极体;;培养16d得到1枚排出pbI的孤雌激活卵;同时发现培养16－18d卵母细胞退化率明显增高（P＜0．01）。推测山羊腔前卵泡卵母细胞体外培养的适宜时间为16d。     

温度、无血清培养对山羊卵母细胞体外成熟的影响

在38℃和39℃不同温度条件下培养山羊卵母细胞,成熟率分别为63．6％和57．3％,差异不显著,说明只要培养温度在山羊正常体温的变动范围内,对其卵母细胞的成熟率没有影响。10 mg/mL BSA代替10％FCS培养山羊卵母细胞成熟率为58．7％,对照组为62．5％,差异不显著,说明无血清培养可以代替血清培养。     

猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养

实验对猪卵母细胞的采集和体外成熟培养(IVM)以及培养液进行研究。结果表明，在卵母细胞的采集过程中，机械破碎法平均每个卵巢所获得的A、B级细胞数(7.00，20.50)要显著多于抽吸法(1.48，2.73)(P＜0.05)。但抽吸法中平均每个卵巢所用的时间(1.05min)却显著少于机械破碎法(15.6min)(P＜0.05)。NCSU-23与TCM-199两种培养液对卵母细胞体外成熟率无显著差异(P＞0.05)。添加10μg／LrpGH比20μg／LrpGH更有利于卵母细胞的成熟(71.5％，45.5％)，两者差异显著(P＜0.05)。     

羔山羊卵巢母细胞体外成熟培养条件的研究

将出生后５０～７０日龄的羔山羊，经超数排卵处理后，从卵泡中抽取卵母细胞，取外观形态正常的卵母细胞分成五组，在含有１０％胚牛血清（ＦＣＳ）的ＴＣＭ－１９９培养液中分别经１２、１６、１８、２０和２４ｈ的体外成熟培养后进行体外受精，探索不同体外成熟培养时间对体外受精及卵裂率的影响，另外，在成熟用培养基内还分别添加了发情母羊血清（ＥＮＧＳ）和ＦＣＳ以观察其次培养效果，结果表明，经过１２～２４ｈ体外成熟培养     

影响山羊卵母细胞体外成熟和受精的因素

卵母细胞体外成熟作为胚胎体外生产技术的开始步骤,具有非常重要的作用。卵巢卵母细胞体外成熟的情况在很大程度上决定着卵母细胞的体外受精率和胚胎发育率。而卵母细胞的体外成熟和受精是在众多因素共同作用下完成的,当其中任何因素发生     

构筑山羊卵母细胞体外成熟体系的研究

通过探讨不同浓度的FSH、LH及HMG对山羊的卵母细胞体外成熟体系影响因素,构筑山羊的卵母细胞的体外成熟体系,为山羊核移植及以后的优良育种奠定基础。