壳聚糖酶生产菌的产酶工艺条件研究

壳聚糖是自然界中唯一一种带阳离子的能生物降解的高分子材料，已广泛应用于农业、医药、食品等领域。其降解产物甲壳低聚糖具有比壳聚糖更好的溶解性和生理活性，采用酶法降解具有反应条件易于控制、产物安全性高和环境污染少等独特的优越性，因此，筛选壳聚糖降解酶的方法和条件有重要意义。对壳聚糖酶生产菌所产壳聚糖酶的培养条件进行了初步研究，并对测定壳聚糖酶酶活力的DNS法进行了研究。结果表明，DNS法的最大吸收波长在495 nm。该实验所用菌种产壳聚糖酶的培养条件以培养时间为60 h，初始pH值为5.0，装液量为50 mL     

热稳定性β-葡聚糖酶菌种选育及产酶特性

从土壤中筛选到一株热稳定性β－1，3－1，4－葡聚糖产生菌ZJF－1，发酵60h酶活性为64U／mL，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。紫外线和硫酸二己酯复合诱变，获得的突变株ZJF－1A5发酵60h酶活性达154．7U／mL，是出发菌株酶活性的2．42倍，对B.subtilis ZJF-1A5产酶特性的研究发现：大麦粉，糊精，可溶性淀粉等糖有利于β－1，3－1，4－葡聚糖酶的产生，葡萄糖，麦芽糖等单糖和双糖不利于菌体生长和产酶。B.subtilis ZJF-1A5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的产生与菌体生长部分相关，在细胞进入对数生长后期至稳定期，酶活性显著增加，且β－葡聚糖酶活性与菌体生物量密切相关，B.subtilis ZJF-1A5 α－淀粉酶的产生也与生长部分相关，细胞进入对数生长期，α－淀粉酶开始大量产生，而中性蛋白酶的产生与菌体生长同步。     

乐果降解酶产生菌的筛选及酶条件的优化

采用室内培养室验方法,从农药长期污染的土样中分离到一株铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐ－１,该菌株可以利用乐果为唯一碳源和能源进行生长,生长的最适ｐＨ为７．０～７．５,最适温度为３０～３５℃。在组分为０．３％蛋白胨,,０．０５％牛肉膏,０．０５％乐果,０．５％ＮａＣＬ的培养基中摇床（３５℃,１５０ｔ／ｍｉｎ）培养２４ｈ,可产生最高乐果降酶活性,达到约８ｕ／ｍＬ。     

小麦种子过氧化物酶的纯化及其部分酶学性质研究

小麦全面粉水抽提液经醋酸酸沉淀,上清再经硫酸铵35%-75%分组沉淀,沉淀溶于pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液,经FPLC-SOURCE 30S 阳离子交换层析,FPLC-Superdex G-75凝胶过滤层析,纯化了小麦种子过氧化物酶（Wheat Seed Peroxidase）,纯化酶的比活力为3912U／mg。在SDS-PAGE上显示出一条蛋白带,其分子量约为37 KD。光谱分析显示,在399nm处有一典型的Soret带,在495nm和636nm处有特征吸收,酶反应的最适pH在5.0左右,最适双氧水浓度为13mM/L,最适温度在40℃左右,有较好的耐热能力。     

β-葡聚糖酶的热稳定性改造及酶学性质分析

为了获得热稳定性有所提高的β-葡聚糖酶，本研究利用定向进化技术对β-葡聚糖酶基因进行改造，并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。结果获得了两株热稳定性有所提高的突变体，分别命名为EGs1和EGs2；酶学性质分析结果显示：与野生酶相比，EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃；突变酶的最适反应温度也提高了5℃，达到了60℃；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28％和降低21.6％；对地衣多糖的亲和力未见改变；野生酶和EGs1突变酶的最适pH值为6.5，而EGs2突变酶的最适pH值为7.0；野生型和突变型-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围，在pH 6.0-8.5的范围内放置48小时，仍保持80％以上的酶活力；遗传稳定性检验结果表明突变株的遗传稳定性良好。这一结果说明了定向进化在改善酶性质方面是比较有效的策略。     

莲子酶解动力学分析与酶解产物多糖的表征

为开发更温和与简便的高纯度植物多糖新型酶法水解提取工艺,该研究以胃蛋白酶（内肽酶）和曲蛋白酶（端肽酶）作为复合酶,建立酶解过程的动力学模型。对上述工艺所提取制备的多糖与45 ℃水提法、90 ℃水提法、胃蛋白酶提取法所制得的莲子多糖进行营养成分分析与结构（单糖组成、红外光谱、热特性、低场核磁和动态热机械）表征。结果显示,单酶（胃蛋白酶）/双酶分段酶解的动力学模型分别为：D_H=2.101ln[1+(0.6133(E₀/S₀)+0.1441)t]和D''_H-D_H1=2.439ln[1+(3.923(E₀/S₀)+1.1756)t];双酶法提取的莲子多糖中多酚浓度（（0.42±0.008）mg/mL）和糖醛酸含量（15.65%±0.98%）最高,而以双酶法制得的莲子多糖蛋白质含量（0.73%±0.24%）最低;4种莲子多糖均含有葡萄糖 (Glc)、阿拉伯糖（Arab）、甘露糖（Man）和鼠李糖（Rha）,其中双酶法提取的多糖中半乳糖醛酸（Gal-UA）和Man的含量较多,分别为10.700%和10.752%;4种多糖均为α-型吡喃糖;双酶提取法相比水提法可有效降低莲子多糖中的蛋白质含量和玻璃化温度,提高结合水含量和亲水能力。酶解动力学模型可为莲子多糖纯化机制提供有效参考,尤其是双酶分段酶解法的特异性强、步骤简便,有利于提取和纯化莲子多糖成分,该研究可为动植物非淀粉类多糖的高质量提取和工业化生产提供理论基础。     

几种农药对棉花过氧化氢酶过氧化物酶活性的影响

通过在棉花生育期喷施不同种类农药，试验测定棉叶内过氧化氢酶、过氧化物酶活性的变化趋势。结果发现，喷施农药后，棉叶的过氧化氢酶、过氧化物酶均一定程度表现出“涨落现象”，表明了在本地区特有的农业环境条件下，农药可能会影响植物的正常生理代谢过程。     

小黄鱼边角料的酶解工艺及酶解液性能研究

为开发利用小黄鱼边角料制备浓缩鱼汤,本研究采用酶解工艺对小黄鱼边角料进行酶解并对其酶解液的功能活性进行研究。以氨基酸态氮含量为指标,通过单因素及响应面试验探究酶制剂种类及添加量、pH值和酶解时间对酶解效率的影响;采用DEAE层析柱对酶解液进行分离纯化,SDS-PAGE凝胶电泳测定酶解多肽的分子量;通过测定酶解多肽对·OH和DPPH自由基的清除率、对细菌生长曲线的影响判断酶解多肽的抗氧化性和抗菌性。结果表明,以碱性蛋白酶为酶制剂,当酶与底物蛋白比为322 U·g^-1、固液比(m:v)为1:2、pH值为11.0、温度为55℃、酶解时间为2 h时,小黄鱼酶解液中氨基酸态氮含量为0.545 2 g·100g^-1;酶解液经DEAE柱分离得到了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四组多肽,其中组分Ⅲ多肽的分子量小于3.3 kDa;当酶解液中氨基酸态氮含量分别为8.62 和25.59 mg·mL^-1时,对·OH和DPPH自由基的清除率分别约为80%和61%;组分Ⅲ多肽对枯草芽孢杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有不同程度的生长抑制作用。本研究为小黄鱼边角料开发浓缩鱼汤及其他综合利用提供了依据。     

灰葡萄孢霉角质酶粗提液酶学特性研究

为探究灰葡萄孢霉角质酶的酶学性质以及角质酶对植物角质层的降解作用,以灰葡萄孢霉为材料,采用角质诱导的方法得到角质酶发酵液,上清液经过分离得到角质酶粗提液,采用分光光度法探究温度、pH值、金属离子及有机溶剂对角质酶活力的影响,并通过扫描电镜探究角质酶粗提液对葡萄角质层的作用。结果表明,灰葡萄孢霉角质酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为7.5,此条件下能够保持较高的热稳定性;Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活有促进作用,而Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺对酶活有抑制作用;甲醇、丙酮、异丙醇对酶活具有促进作用,乙醇、乙腈和三氯甲烷对酶活具有抑制作用;角质酶粗酶液对葡萄角质层具有明显的降解作用。本研究结果为果蔬采后病害的控制提供了理论依据。     

辐照诱导的新雄性不育系过氧化物酶和脂酶同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法,对甘蓝型油菜细胞质雄性不育系Polima、Shan2A、Ogu和辐照处理的新雄性不育系Xin1和Xin2及其保持系Shan2B的种子进行了脂酶和过氧化物酶分析,结果表明:5个细胞质雄性不育系比保持系Shan2B多1条迁移率为0.45的脂酶(EST)谱带;Xin1、Shan2A和Polima各有4条过氧化物酶(POD)谱带,保持系缺少1条迁移率为0.61的POD谱带,推测这一同工酶的表达可能与雄性不育相关。     

钼对冬小麦不同品种过氧化氢酶和过氧化物酶活性的影响

低温诱导缺钼现象已得到了一些实验的证实。低温下很多植物易受冷害袭击的一个关键原因是冷胁迫下活性氧（Active oxygen species，AOS；Reactive oxygen species，ROS）的产生及其对植物细胞的直接伤害。过氧化物酶和过氧化氢酶是植物体内主要保护酶类，对清除植物体活性氧，减轻活性氧的细胞伤害，提高植物抗寒性起着重要作用。在冬季低温寒害袭击时，筛选获得的钼高效冬小麦品种97003几乎未出现可见缺钼症状，而钼低效品种97014出现严重缺钼症状。推测其过氧化物酶与过氧化氢酶的活性高低与低温缺钼下冬小麦缺钼症状的出现及轻重有关。通过测定不同时期不同冬小麦品种过氧化物酶和过氧化氢酶活性的变化，探讨冬小麦不同品种低温期缺钼症状显著差异原因，揭示低温诱导缺钼的可能机理。     

N+注入选育漆酶高产菌株及其产酶优化研究

以糙皮侧耳Pleurotus ostreatus WY01为出发菌株,通过N+注入诱变处理担孢子、RBBR-PDA平板变色法初筛、ATBS法测定漆酶活性复筛,获得1株漆酶高产诱变菌株ADW-08。用高碳低氮无机盐制备的油菜秸固体培养基（SM）培养,其峰值酶活力比出发菌株高出2.80倍,达7.78 U/g,且产酶稳定。对ADW-08固体培养产酶条件的研究表明,以葡萄糖为碳源明显优于蔗糖、麦芽糖、麸皮和可溶性淀粉;酒石酸铵较有利于ADW-08漆酶的分泌;适宜初始pH为5.0或6.0;ABTS和藜芦醇对产酶均有明显的诱导作用,而吐温-80对产酶有一定的抑制作用;正交试验结果表明,葡萄糖、酒石酸铵和pH最佳参数分别为15.0g/L、0.2g/L和5.2,酶活峰值为8.33 U/g。     

重组水稻几丁质酶的发酵生产、纯化及酶学性质

用7L发酵罐对毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株NB01进行了重组几丁质酶的诱导表达,通过提高通气量和调整搅拌转速,使溶氧维持在30%以上,NB01可在发酵84 h内达到产酶高峰,酶活最高可达48.0795 U/mL.利用中空纤维超滤膜对发酵液浓缩、提纯,再经过Sephadex G-100柱层析后得到单一组分的重组几丁质酶,酶纯度提高了7.9961倍.重组几丁质酶在60℃以下具有良好的热稳定性,在pH 2～6范围内有较强的耐受力,在4℃条件下贮藏具有较好的稳定性.     

原位酶谱技术在土壤酶学中应用的研究进展与展望

土壤酶在土壤生态系统的物质循环和能量流动方面具有重要的作用,对其活性的检测是土壤酶学发展的基础.传统的土壤酶活检测手段可以反映土壤酶的活性,但是不能原位反映土壤酶在土壤中的真实情况以及区分酶活在时间、空间上的连续变化情况.原位酶谱技术以荧光底物为基础,能原位获取土壤酶活性分布的二维图像,从微观尺度反映其在空间上的连续变...     

纤维糊精酶DM1与CBD的融合及融合酶性质分析

纤维糊精酶（cellodextrinase）属纤维素酶类中的一类,可以从短链纤维素分子上水解糖苷键生成葡萄糖或纤维二糖。曾克隆了纤维糊精酶DM1的编码基因,该酶与生黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）的Cellodextrinase A的一致性为52％。通过人工合成基因的方法合成了细菌来源的3个分别为家族_4_9（GenBank索引号为AAA73869）、家族Ⅲc（GenBank索引号为BABB33148）和家族10（GenBank索引号为CAA60493）的纤维素结合功能域（CBD）和连接桥（linker）的DNA序列。通过把编码纤维糊精酶DM1（GenBank索引号为ACA61162）的催化功能域（CD）的DNA序列与合成的CBD和连接桥的DNA序列进行融合,构建了3个融合酶,并分别在大肠杆菌BL21中得到过量表达。纤维素结合实验表明,3个纯化的融合酶对结晶纤维索（Avicel）和滤纸粉末均有结合能力,融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc与结晶纤维素（Avicel）结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为58．60％、51．16％和21．13％,与滤纸粉末结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为65．59％、60．47％和22．54％,证实与原始酶相比3个融合酶的CBD均有纤维素结合的功能。酶学特性研究表明,融合酶的最适pH、最适温度、pH稳定性和温度稳定性等没有显著改变,均未检测到3个融合酶有新的活性,但它们对p-nitrophenyl β-D-cellobioside（pNPC）、p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（pNPG）和lichenan等底物的比活力显著降低。3个融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc对pNPC的比活力分别为原始酶DM1的26％、2％和2％,对lichenan的比活力分别为原始酶DM1的12％、8％和2％,几乎检测不到后两个融合酶对pNPG的酶活。     

食用明胶的酶解及其酶解物的甲醛捕获特性研究

以氨基含量为响应值,通过Box-Behnken中心组合试验对碱性蛋白酶酶解食用明胶的工艺条件进行优化,并进一步研究明胶酶解物的甲醛捕获特性.结果表明:(1)碱性蛋白酶酶解食用明胶的最佳工艺条件为:加酶量2667U·g-1,温度61℃,pH值8.0,时间180min,在此条件下,所得酶解液的氨基含量为0.277mol·L-1.(2)酶解物能捕获甲醛,其甲醛捕获率受酶解物浓度、反应温度、反应时间及pH值的显著影响,与酶解物浓度、反应温度和反应时间呈正相关,碱性环境有利于酶解物对甲醛的捕获.100℃反应1h,1％浓度酶解物的甲醛捕获率在pH值为7时达51.09％,pH值为9时高达82.77％.     

普鲁兰酶氮端氨基酸的截短对其酶学性质的影响

淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域.普鲁兰酶(pullulanase,pulA,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α-1,6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率.因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义.课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pulA基因(GenBank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中异源表达.为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45 ℃,二者的最适pH分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204U/mg,是M1的1.6倍.动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.001 3μmoL/(mL·s)-1、191.80-1 s.-1、0.30 mg/mL、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍.本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路.