bcl—2基因在成年和胚胎鸡免疫器官中的表达及其与细胞凋亡？…

用一步法从１７日龄来克亨ＳＰＦ鸡胚和９０日龄成年鸡的法氏囊、脾脏和胸腺组织中提取总ＲＮＡ（ＴＲＮＡ）,用鸡Ｂ－细胞淋巴瘤／白细胞病－２基因（ｂｃｌ－２）ｃＤＮＡ探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交。发现ｂｃｌ－２在成年和胚胎鸡的不同免疫器官中表达量不同,成年鸡ｂｃｌ－２的表达量多少依次为胸腺、脾脏、法氏囊,而胚胎鸡则是胸腺、法氏囊、脾脏。同时用流式细胞法测定这些器官的细胞凋亡情况,胚胎鸡法氏囊、     

细胞凋亡基因P53在固始鸡免疫器官内的表达及其生理意义

【研究目的】探讨细胞凋亡基因p53在固始鸡免疫器官内的表达及其生理意义;【方法】应用免疫组织化学技术和Leica显微图像处理系统;【结果】p53阳性蛋白表达于法氏囊和胸腺内淋巴细胞细胞膜、细胞质和细胞核。在不同发育阶段固始鸡法氏囊内均有少量p53表达阳性细胞,阳性细胞主要分布于黏膜上皮层与淋巴小结之间靠近上皮层的固有膜内,其次是淋巴小结边缘及淋巴小结与淋巴小结之间的固有膜层内。在1周龄和12周龄固始鸡胸腺内有少量p53表达阳性细胞,阳性细胞主要分布于胸腺小叶皮质与髓质交界处,其次是皮质内,很少出现在髓质内。p53在不同发育阶段固始鸡脾脏内均无表达;【结论】在正常生理情况下,细胞凋亡基因p53参与了固始鸡中枢免疫器官内淋巴细胞发育分化过程中的凋亡调控,对免疫器官的稳定发挥重要作用。     

固始鸡免疫器官内细胞凋亡基因Fas和FasL的动态表达

 【目的】探讨固始鸡免疫器官内细胞凋亡基因Fas和FasL的动态表达。【方法】应用免疫组织化学技术和Leica 显微图像处理系统,对细胞凋亡基因Fas和FasL在固始鸡免疫器官内的动态表达进行研究。【结果】Fas在不同发育阶段固始鸡免疫器官内均有表达,但表达量均不相同,呈波浪样动态变化;Fas表达于固始鸡免疫器官内淋巴细胞细胞膜和细胞质,不表达于细胞核;Fas表达阳性细胞在固始鸡不同免疫器官内分布位置不同,呈散在或簇团状分布：法氏囊内阳性细胞主要分布于黏膜靠近上皮细胞的固有膜层内、淋巴小结与淋巴小结之间区域、淋巴小结边缘,淋巴小结内少量淋巴细胞也有Fas表达;胸腺内主要分布于胸腺小叶髓质,极少出现在皮质内;脾脏内主要分布于红髓和边缘区、淋巴小结周围和动脉周围淋巴鞘周围的区域,动脉周围淋巴鞘极少有Fas表达,淋巴小结无Fas表达。FasL在固始鸡免疫器官内的表达与Fas相似,但表达量与Fas相比较少。【结论】细胞凋亡基因Fas和FasL参与了固始鸡免疫器官内淋巴细胞发育分化过程中的凋亡调控,并对免疫器官的稳定发挥重要作用。     

鸡ANP32家族蛋白亚细胞定位及其在免疫器官中的表达特征分析

【目的】明确鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位及在不同月龄鸡免疫器官中的表达特征,为后续研究鸡ANP32家族蛋白与新城疫病毒（NDV）复制及其致病性的关系打下基础。【方法】分别构建鸡ANP32家族基因重组真核表达载体,转染HEK-293T细胞后进行诱导表达,利用Western blotting检测融合蛋白表达情况,并通过荧光观察分析融合蛋白亚细胞定位;同时采用实时荧光定量PCR检测ANP32家族基因在1～6月龄鸡免疫器官（脾脏、胸腺和法氏囊）中的表达水平。【结果】成功构建了鸡ANP32家族基因重组真核表达载体pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E,转染HEK-293T细胞后得到正确表达,获得携带EGFP标签的融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFPANP32B和EGFP-ANP32E,其分子量分别为60.0、57.9和56.9 k D。亚细胞定位分析结果表明,融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的荧光与细胞核荧光完全重合,即主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明,ANP32家族基因...     

鸡bcl-2表达质粒的构建及其对转染细胞凋亡的影响

 构建了 CMV驱动及牛生长激素 poly A加尾信号修饰的 bcl- 2 c DNA真核表达质粒p CDCB1。随后 ,采用脂质体转染方法 ,将扩增并纯化的 p CDCB1转染至培养的 SPF鸡胚次代单层成纤维细胞 (CEF)内 ,96h后收集全部贴壁及上清脱落细胞 ,用 Dotblot检测 bcl- 2的表达 ,用流式细胞术测定其细胞凋亡率。结果 ,p CDCB1转染后 96h,bcl- 2在 CEF中呈高度表达 ;CEF平均凋亡率为 1 .1 4% ,明显低于转染空白载体质粒的对照组 7.64%的凋亡率 ,DNA合成期 (S期 )细胞为 2 1 .58% ,也低于对照组。结果证实鸡 bcl- 2 的表达可显著抑制体外培养 CEF凋亡进程 ,其效应与细胞 DNA合成和增殖无关。     

感染鸡贫血因子病毒雏鸡免疫器官T细胞变化

对１日龄感染和未感染鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）雏鸡的免疫器官组织Ｔ细胞数量的动态变化进行了检测．结果发现，１日龄雏鸡感染ＣＩＡＶ后，其中枢免疫器官胸腺、法氏囊和外周免疫器官脾脏以及局部免疫组织盲肠扁桃体和哈德尔腺的Ｔ细胞数量，于感染ＣＩＡＶ后７～２８ｄ较对照组明显减少，表明１日龄感染ＣＩＡＶ雏鸡免疫器官组织的细胞免疫功能明显降低．     

萧山鸡IL-2基因真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因，将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2，高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌，并直接转染Vero细胞，提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号．用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验，可检测到特异性黄绿色荧光．SDS-PAGE和Western blotting可检测到18．5kD和14．5kD的蛋白条带．表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2，且表达产物具有免疫反应性，为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据．     

鸡胚胎及其部分组织器官生长发育的研究

选择苏禽 96鸡胚胎从孵化 3 d开始至 1 8d止 ,对胚胎及其部分组织器官进行测量 ,并对各测量值进行生长分析。结果表明 :胚胎和部分组织器官的重量和长度逐日增长 ,呈先快后慢的生长发育特点。相对生长分析表明 :生长最强烈的时期正是胚胎组织器官处于分化的时期 ,其新陈代谢最旺盛。在孵化 7～ 9d,相对生长速度除体重和肺脏之外 ,其余器官均呈现强烈的生长 ,而体重和肺脏则分别在孵化 3～ 5和 1 3 d出现强烈的生长。绝对生长分析表明 :各个组织器官随分化而加快生长 ,一旦器官分化方向决定 ,则开始加快生长。体重、心脏重、肝脏重、前肢重、后肢重、胫长、喙长等性状在孵化 1 0～ 1 1 d,绝对生长速度开始加快 ,1 6d时达到生长高峰期。体长和头长的绝对生长速度出现快慢交替的波浪式生长规律。累积生长分析表明 :同一时期各器官生长速度不一致 ,可能与其功能需要有关。体重、肝脏重、肺脏重、卵巢重、睾丸长、头重、喙长等性状的累积生长逐日平缓生长 ,起伏不大 ,而体长、心脏重、头长、前肢重、后肢重、前肢长、后肢长、第 3趾长、胫长、眼泡直径等性状的累积生长 ,从孵化 5～ 6d开始加快速度生长 ,持续到 1 6d达到高峰期 ,以后开始缓慢增长     

萧山鸡IL-2基因真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因,将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2,高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌,并直接转染Vero细胞,提取细胞总DNA,DIG标记探针可检测到阳性杂交信号.用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验,可检测到特异性黄绿色荧光.SDS-PAGE和Western blotting可检测到18.5 kD和14.5 kD的蛋白条带.表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2,且表达产物具有免疫反应性,为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据.     

金刚烷胺中毒对鸡免疫器官及抗氧化功能的影响

试验旨在探讨金刚烷胺中毒对鸡免疫器官和抗氧化功能的影响。选择40日龄的健康海兰蛋鸡60只,随机分为3组,每组20只,饲喂相同的基础日粮。对照组正常饮水,低剂量组饮水中金刚烷胺的含量为1g·L^-1,高剂量组饮水中金刚烷胺的含量为2g·L^-1,分笼常规饲养,连续给药3d,饲养期内观察鸡的临床表现,43日龄时剖杀,取脾脏、胸腺、法氏囊和血清用于T-AOC、MDA、SOD指标的检测。试验结果表明,随着金刚烷胺给药量的增加,脾脏、胸腺、法氏囊和血清中的SOD和T-AOC呈下降趋势,MDA呈上升趋势;低剂量组和高剂量组与对照组相比差异均极显著（P〈0.01）。表明金刚烷胺中毒可明显影响免疫器官和抗氧化系统功能的改变,证实金刚烷胺用量过大可以产生毒副作用。     

鼻咽癌中E-cadherin及β-catenin的表达对Bcl-2基因表达的影响

目的：了解鼻咽癌组织细胞中E-cadherin(上皮钙粘附素)及pcatenin(β环连素)的表达对bcl-2基因表达的影响。方法：利用免疫组化方法检测74例鼻咽癌组织细胞中E-cadherin、p-catenin及bcl-2基因表达．计算各例的阳性表达率.通过非参数样本Wilcoxon秩和检验．检验E-cadherin、β-catenin和bcl-2之间的相互关系。结果：74例鼻咽癌中E-cadherin 72例显示不同程度阳性表达，73例表达β-catenin。bcl-2在65例中显示不同程度阳性表达，阳性率皆为5％～100％不等。经检验，bcl-2中位阳性率明显低于E-cadherin及β-catenin的中位阳性率(Z=-3．021．P=0．003；Z=-3．263．P=0．001)．且随着E-cadherin及β-catenin阳性率增高而减低。其中．24例伴有胞浆pcatenin阳性表达的鼻咽癌中。bcl-2表达明显低于非胞浆表达组(z=2．017．P=0．014)。结论：鼻咽癌中E-cadherin的增强表达可降低bcl-2基因的表达，β-catenin异位表达可能在调节bcl-2基因的表丛中起重霉的作用．     

柠檬酸对小鼠脑组织bcl-2表达的影响

为了探讨柠檬酸对机体的毒副作用,选用昆明系健康雄性小鼠40只,随机分成4组,每组10只,饲养1周后,腹腔注射一定剂量的生理盐水及低(180mg·kg-1)、中(270mg·kg-1)、高(360mg·kg-1)质量浓度的柠檬酸溶液.每周注射1次,连续注射3周,第3次注射后的第7天,所有小鼠均颈椎脱臼处死,采取小鼠的脑组织分别于液氨和-20℃各保存1份备用.通过RT-PCR法和ELISA法分别检测小鼠脑组织中bcl-2基因表达水平和蛋白表达量.结果显示,柠檬酸处理组与对照组相比,bcl-2基因表达水平均无统计学上的差异(P＞0.05);中剂量柠檬酸处理时,bcl-2蛋白的表达量达到最高值,且与对照组呈现显著差异(P＜0.05),上升了23％,柠檬酸高剂量组与中剂量组相比,bcl-2蛋白的表达量呈显著降低(P＜0.05);其它组间均无统计学上的差异(P＞0.05).说明腹腔注射270mg·kg-1的柠檬酸可显著提高小鼠脑组织bcl-2蛋白的表达量;但本试验设置的柠檬酸梯度对bcl-2基因表达水平无显著影响.     

bcl-2/EGFP融合基因真核表达质粒的构建

为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用RT-PCR方法从鸡新城疫 系疫苗接种鸡胚的脾淋巴细胞中扩增出IL-2基因cDNA。结果表明,以鸡新城疫 系疫苗稀释50倍或100倍接种10日龄鸡胚,培养48h的脾脏提取mRNA的扩增效果最好。测序结果显示,所扩增片段的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,与已发表的IL-2基因的同源性分别为97.7%～99.8%和95.1%～99.3%。其中第8位、68位和130位氨基酸(分别是L,V和S)的变异是其他品种鸡所没有的。     

鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎bcl-2、P53基因表达的差异及发育性变化

 【目的】探讨细胞凋亡因子bcl-2、P53对鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎发育的影响。【方法】人工授精获得鸡（♂）与鹌鹑（♀）杂交种蛋,按照鸡标准孵化条件同批入孵,随机采集66、72、78、84、90、96、102、108、114、120 h活胚。采用RT-PCR方法,用Wpkci和β-actin引物进行多重PCR鉴定胚胎样本性别,后选取各时间点雌、雄胚胎各4枚,以β-actin为内标,测定bcl-2、P53的mRNA相对丰度。【结果】（1）雄性胚胎66～114 h bcl-2 mRNA表达维持在较低水平,96 h 有所降低,随后回升到原水平,120 h 极显著升高（P＜0.01）,达到峰值;雌性胚胎66～114 h bcl-2 mRNA表达维持在较低水平,114 h 极显著升高（P＜0.01）,此后维持在较高水平,120 h 达到峰值。不同日龄之间的比较,114 h雌性表达显著高于雄性（P＜0.05）;（2）雌、雄胚胎P53 mRNA发育性表达模式基本一致。66 h表达水平较高,72 h表达降低,达到低谷,雄性达到显著（P＜0.05）,雌性整体差异不显著,随后上升维持在原水平;不同日龄之间表达差异不显著。【结论】114 h雌性胚胎bcl-2 mRNA表达高峰点与其P53 bcl-2表达最低水平相吻合;72 h雌、雄胚胎 P53 mRNA表达与P53 bcl-2表达水平一致,处于低谷点;72、114 h早期杂交胚胎bcl-2、P53基因表达出现异常。     

鸡IL-2基因cDNA输卵管组织特异性表达载体的构建与表达

将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。     

雏鸡脑软化症主要免疫器官的病理学研究

用人工复制的脑软化症患雏模型 ,研究其主要免疫器官病理解剖学变化、病理组织学变化以及超微结构的变化。结果表明 ,患雏免疫器官萎缩、变性和淋巴细胞坏死。