茶树叶片β-葡萄糖苷酶基因的原位PCR研究

β-葡萄糖苷酶(EC3,2,1,21)属于水解酶类,可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键,同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基。茶叶中β-葡萄糖苷酶与萜烯类香气前体有密切关系,使糖苷由键合态变成游离态。最早是1981年日本的Takeo T[1]在茶叶匀浆中添加β-葡萄糖苷酶后,能产生芳樟醇和香叶醇,证实茶叶中存在以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇。目前,对茶叶中β-葡萄糖苷酶的研究已延伸至对其活性及与茶树品种[2]、加工工艺[3-4]的关系。目前已从燕麦[5]、蜀黍[6]、旱金莲[7]、长春花[8]、黄檀[9]等植物中克隆出β-葡萄糖苷酶基因并进行了表达。此…     

茶树β-葡萄糖苷酶研究进展

茶树体内的各种物质代谢、能量传递以及生长发育等都必须有酶的参与,而且酶对茶叶品质的形成具有重要意义。β-葡萄糖苷酶能够催化茶树糖苷类香气前体的水解反应,产生的茶树香气物质不仅参与茶树对病虫害的防御反应,还是茶叶重要的物质基础。茶树β-葡萄糖苷酶基因在表达部位、亚细胞定位、蛋白结构及系统发育进化等生物信息学方面,与拟南芥、水稻、玉米等植物的β-葡萄糖苷酶基因家族都存在相似性。在非生物和生物逆境胁迫下,茶树β-葡萄糖苷酶基因表达在逆境初期均呈现上调。本文将主要围绕茶树β-葡萄糖苷酶基因生物信息学及基因表达等研究现状,结合β-葡萄糖苷酶在茶叶加工中的变化作一概述。     

茶叶β-葡萄糖苷酶的研究进展

茶叶中的香气物质大多是以香气前驱体的形式存在,而其中又以葡萄糖苷为主。这些以葡萄糖苷形式存在的香气物质在β-葡萄糖苷酶的作用下,酶解释放出挥发性的香气物质,各种香气物质以不同的浓度组合就构成了茶叶所特有的香气品质。本文着重阐述茶叶中β-葡萄糖苷酶生化特性及分子生物学方面的研究进展,以及相关的一些应用。     

茶树β-葡萄糖苷酶基因mRNA的表达（摘要）

采用原位杂交技术对茶树β-葡萄糖苷酶基因mRNA的表达进行了研究。结果表明，β-葡萄糖苷酶基因mRNA主要在茶树叶片栅栏组织、叶主脉的薄壁组织表达；不同品种之间的表达位置基本相似，但表达信号却有差异，以龙井43号最强，福鼎大白茶、槠叶齐次之，而大叶乌龙、迎霜最弱。结果还显示，不同季节的表达信号以春梢最强，秋梢次之，夏梢最弱。[第一段]     

β-葡萄糖苷酶在茶叶加工过程中的研究进展

β-葡萄糖苷酶,属于葡萄糖水解酶类,能够水解结合于末端非还原性的β-葡萄糖苷键,同时释放出β-葡萄糖和相应的配基。其广泛存在于各生物体中,β-葡萄糖苷酶是茶叶重要的水解酶类之一,而不同的茶叶品种,生产产地季节,加工工艺等很多因素都能影响β-葡萄糖苷酶的活性,保持β-葡萄糖苷酶的高活性对影响茶叶的香气和品质有重要作用。本文综述了不同茶类制作工艺、不同栽培环境、不同叶位等的β-葡萄糖苷酶的活性变化。     

β-葡萄糖苷酶与茶增香及抗病虫害的研究进展

分析了与茶叶香气形成相关的β-葡萄糖苷酶研究现状及其对茶叶增香、病虫害抗性的作用,并阐述了β-葡萄糖苷酶基因的研究进展及其对茶树优良品种选育的重要性。     

武夷岩茶加工过程β-葡萄糖苷酶对香气形成的影响

通过分析武夷岩茶水仙和肉桂加工过程中β-葡萄糖苷酶活性以及香气成分,探讨β-葡萄糖苷酶对水仙和肉桂加工过程香气形成影响的差异性。结果表明,水仙香气含量和β-葡萄糖苷酶活性低于肉桂,但加工过程香气和β-葡萄糖苷酶活性变化率高于肉桂:水仙β-葡萄糖苷酶活性与香气、橙花叔醇、香叶醇均呈高度指数负相关,相关系数分别为0.931、0.973、0.999,与芳樟醇、雪松醇分别呈高度、较高指数正相关,相关系数分别为0.947、0.872:肉桂β-葡萄糖苷酶活性与香气、柽花叔醇、香叶醇、芳樟醇氧化物I呈较高指数负相关,相关系数分别为0.897、0.888、0.869、0.882。     

茶叶β-葡萄糖苷酶亲和层析纯化与性质研究

以化学合成的β-葡萄糖苷酶的抑制剂β-葡萄糖脒为配体,通过N-糖苷键交联到支持物上,使糖脒N-糖苷键一侧的氨基保持带正电荷的活化状态,合成了一种β-葡萄糖苷酶的亲和层析树脂。这种合成的亲和层析树脂在弱酸条件下非常稳定,能选择性地吸附β-葡萄糖苷酶,并能多次重复使用。利用这种亲和层析树脂,在pH6和pH5条件下,从薮北种茶树叶片中纯化出两种分子量分别为63和75kDa的β-葡萄糖苷酶单体酶。以对硝基苯酚β-葡萄糖苷为底物,研究了两种酶的性质。TLC分析结果表明,这两种β-葡萄糖苷酶都能水解(Z)-3-己烯醇、苯甲醇和苯乙腈的β-D-葡萄糖苷。     

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。     

牛樟芝不同发育阶段菌丝体实时荧光定量PCR中内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）技术具有较高的敏感性、准确性和特异性,被广泛应用于基因表达分析。在基因表达分析中,选择合适的内参基因是衡量样品表达量和准确性的重要前提和保障。本研究以液体发酵7、21、35 d的牛樟芝菌丝体为样本,采用qRT-PCR技术检测牛樟芝菌丝体内Actin、TPK、Floxuridine、CAP-Gly、α-Amylase、Phosphatase、HA2-helicase、MAGT1等8个候选内参基因在3组样本中的表达水平,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3个软件对其分别进行稳定性比较和评价。结果表明,geNorm软件计算得出Floxuridine、HA2-helicase、TPK、CAP-Gly在牛樟芝菌丝体中具有更高的稳定性;NormFinder软件计算得出TPK、CAP-Gly、Floxuridine、HA2-helicase在牛樟芝菌丝体中具有较高的稳定性;BestKeeper软件计算得出HA2-helicase的表达水平最好,其次是TPK和MAGT1。综合分析结果认为TPK和HA2-helicase比其他内参基因更稳定,更适合作为牛樟芝菌丝体研究的内参基因。可见,通过牛樟芝菌丝体转录组数据来筛选和挖掘稳定表达的内参基因具有可靠性、高效性和可行性,为牛樟芝菌丝体基因表达分析提供了可靠的内参基因。     

菠萝蜜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选菠萝蜜实时荧光定量PCR研究用的内参基因,以菠萝蜜不同发育阶段的果实、叶和花序为材料,分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的表达情况,并对其表达稳定性进行分析。结果表明,在各组织不同发育阶段中,5个内参基因的表达丰度变化存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法得出的结论有所不同,经RefFinder综合评价后,果实中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA;叶片中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin;花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。     

茶树叶片GDH、GS、GOGAT基因的克隆及荧光定量PCR分析

以4个茶树种质为试验材料,克隆得到茶叶中氨基酸合成转化关键酶基因：谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺α-酮戊二酸氨基转移酶（GOGAT）的保守区。在GenBank登录号分别为：JN602371、JN602372、JN602373。通过SYBR Green I实时荧光定量PCR检测,发现GDH酶基因在茶树种质0314C（相对高氨基酸种质）中的表达显著增强,而在0212-15种质（相对低氨基酸种质）中却显著下降。GS、GOGAT酶基因在种质0314C中表达显著下降,而在0212-15、0318D种质中显著增强。通过回归分析,GS基因表达与茶氨酸、赖氨酸、丙氨酸呈负相关,而GDH与茶氨酸呈正相关。     

甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择

以甘蔗接种黑穗病菌后0、6、12、24、48、60和72 h时间点的材料为研究对象,应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR Real-time qPCR)技术,探讨25S rRNA、GAPDH、β-actin和β-tubulin4个内参基因mRNA水平的表达情况.经geNorm程序统计学分析,4种内参基因的表达稳定性各异,25S rRNA>GAPDH>β-actin>-tubulin,其中以25S rRNA表达稳定性最好,且根据该基因设计的两对定量PCR引物都是可行的.同时,甘蔗PPO基因表达特性的定量PCR分析也显示,甘蔗PPO基因与植物的抗病性相关.结果显示,研究中所筛选的内参基因是合适的.     

番木瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因时空表达的荧光定量PCR分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)是类胡萝卜索生物合成过程中的关键酶之一,它催化ζ-胡萝卜素转化成链孢红索,并催化链孢红素向番茄红素的转化.ZDS是限速酶,在植物果实颜色和花色发育过程中起着重要作用.本研究以番木瓜黄果品种DwaIf solo和红果品种Sunrlse solo为材料,采用实时荧光定量PCR SYBR Green I荧光染料法,对2个番木瓜品种的不同组织器官及果实发育成熟过程中的ZDS基因在转录水平上的表达进行了相对定量分析.结果表明,2个番木瓜品种的果实、花、叶片中均可检测到ZDS基因在转录水平上的表达,但表达量存在组织和部位上的差异.ZDS基因在成熟果实中的表达量比花中的高,花中的比叶中的高.ZDS基因在Sunrise solo (红果肉)番木瓜果实发育成熟过程中的表达逐渐增强,且变化显著,而在Dwarf solo(黄果肉)番木瓜果实早期表达增强,成熟后期则表达趋为稳定.2个番木瓜品种成熟果肉中ZDS基因表达量存在差异,红果肉中的表达量高于黄果肉.     

澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

澳洲坚果是重要的热区经济作物,目前国内外尚无关于澳洲坚果实时荧光定量PCR分析内参基因的报道。选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的先决条件。为筛选澳洲坚果实时定量PCR最适内参基因,以澳洲坚果的根、茎、叶、果皮、果仁为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11个常用的内参基因在澳洲坚果不同组织中的表达稳定性进行了分析。geNorm软件分析的最适内参基因数目为2,最稳定内参组合为MDH和EF1b,TUBa基因的稳定性最差。BestKeeper分析结果认为,MDH基因表达最稳定,EF1b次之,与geNorm结果一致。NormFinder软件稳定性分析显示,GAPDH最稳定,其次是CYP基因;TUBa基因表达最不稳定。ΔCt算法结果表明,18S基因表达最稳定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder综合排序为：MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲坚果不同组织中表达最稳定,初步确认可以作为实时荧光定量PCR分析的校正内参基因,在澳洲坚果的基因表达模式分析中具有重要意义。     

大麦β-葡聚糖酶的研究和展望

主要存在于大麦糊粉层和盾片中的大麦 β -葡聚糖酶 (1,3- 1,4 - β -葡聚糖酶 )属于诱导酶 ,种子萌发期间受赤霉酸 (GA)诱导而激活。 1,3- 1,4 - β -葡聚糖酶和 1,3- β -葡聚糖酶基因是 β -葡聚糖酶基因家族中两类 ,这两类β -葡聚糖酶水解酶具有不同的特性和功能 ,它们与大麦的制啤和抗病密切相关 ,遗传工程将为大麦的品质改良和选育抗病品种提供新的机遇。     

青稞幼苗期叶片中 SBEⅡa基因的克隆及其表达分析

为进一步研究淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)在青稞叶片淀粉代谢中的作用,以青稞品种喜马拉雅2号和康青1号为材料,通过同源克隆技术分离 SBEⅡa基因,并对分离得到的 SBEⅡa基因进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和淀粉分支酶活性测定试剂盒分析了在高温、低温和盐胁迫条件下 SBEⅡa基因的表达情况和SBEⅡa蛋白酶活性的变化情况。结果表明,从喜马拉雅2号和康青1号克隆得到的 SBEⅡa基因ORF区为2466 bp,编码821个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为92.09 kDa,预测等电点(pI)为5.4,是酸性蛋白;该蛋白酶的不稳定系数为38.03,属于稳定蛋白;参试材料与大麦的亲缘关系最近,与细江蓠的亲缘关系最远。qRT-PCR和蛋白酶活性测定结果表明, SBEⅡa基因在不同环境下表达水平和SBEⅡa蛋白酶活性变异具有高度的正相关性,在不同环境和不同材料之间没有明显差异。     

油梨和羊奶果果肉粗提物对α-葡萄糖苷酶的体外抑制

收集不同油梨和羊奶果资源,对油梨和羊奶果果肉粗提物进行α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性实验。结果表明：16份油梨果肉对α-葡萄糖苷酶抑制活性较弱,而9份羊奶果果肉对α-葡萄糖苷酶抑制活性较强,其中羊奶果6号对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强,达到99.84%,仅次于阿卡波糖。