DOF转录因子AtDof1.7 RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。     

RNA干扰及其对昆虫抗药性相关基因的沉默研究

以不同农药为主的防治策略对棉铃虫和小菜蛾等农业害虫的控制卓有成效,但易产生害虫抗药性问题。害虫抗药性与细胞色素P450酶系、酯酶、钙粘蛋白等酶或受体的生化与分子机理相关。RNA干扰(RNA in-terference,简称RNAi)作为分子生物学领域中功能基因及基因组研究的一种强有力工具,已逐渐用于昆虫抗药性相关基因的敲除研究并鉴定其功能。本文围绕RNAi的作用机理及其对昆虫抗药性相关基因的沉默研究展开综述,旨在为农业害虫及其抗药性治理提供新思路与新途径。     

水稻WRKY转录因子OsWRKY76 RNA干扰载体的构建及表达分析

为研究水稻WRKY蛋白在应对各种生物以及非生物胁迫中发挥的作用,探明OsWRKY76是否参与调控水稻系统获得抗性,明确OsWRKY在植物抗病及耐逆反应过程中的作用机理,对OsWRKY76进行了氨基酸序列分析,发现OsWRKY76具有典型的WRKY结构域,属于WRKY-GCM1锌指WRKY超家族。克隆了OsWRKY76中300 bp的cDNA片段OsWRKY76-300,并扩增GUS基因中500 bp的片段作为连接物,通过片段末端人为增加的酶切位点将上述片段与Gateway系统的入门载体pENTR L16连接,形成中间由GUS 500连接、两端是OsWRKY76-300反向重复的发夹结构的载体,利用LR反应将dsWRKY76 pENTR L16中发夹结构的插入片段分别重组到诱导型双元载体GVG-TA7002和组成型双元载体Ubi-C1300中,获得RNA干扰载体。利用农杆菌介导的转化方法将诱导型双元表达载体转化水稻,获得7个转化株系。利用实时定量RT-qPCR检测转化株系中OsWRKY76的表达量,获得了2个沉默株系。     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

富有柿果ACC合成酶基因RNA干扰植物表达载体的构建

分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。     

基于大豆花叶病毒衣壳蛋白基因的RNA干扰植物表达载体的构建

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的探索奠定基础。     

甜菜BvWRKY23基因的RNAi载体构建

WRKY转录因子家族成员在调控植物生长发育、应答生物与非生物胁迫等方面具有重要的生物学功能。以抗旱甜菜（Beta vulgaris L.）幼苗为材料,提取叶片总RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR方法扩增获得甜菜WRKY转录因子家族成员BvWRKY23基因的RNAi靶片段,以中间载体PBSK-RTM作为媒介,利用传统的“酶切-连接”法构建了含有CaMV 35S启动子、BvWRKY23基因片段反向重复序列的RNAi（RNA interference）植物表达载体pCambia2301ky-BvWRKY23-RNAi。     

AtTPS03基因RNA干扰载体的构建及拟南芥转化

本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上.对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%.根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗.这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础.     

紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建

根据紫花苜蓿2级标准品种Vernal PhyB基因的序列(GenBank登录号为GQ379903.1),设计2对含有酶切位点的特异性引物F1/R1和F2/R2,以紫花苜蓿总RNA为模板,通过RT-PCR法扩增得到PhyB基因正向、反向目的片段,将片段连接到pGEM-T Easy载体上得到重组载体pGEMB-1和pGEMB-2,再以中间载体pHANNIBAL和植物双元表达载体pART27为基础,通过多次酶切和连接,成功地构建了紫花苜蓿PhyB的RNAi表达载体。为进一步研究光敏色素B与苜蓿秋眠性之间的关系奠定了基础。     

棉花纤维素合酶基因GhcelA1克隆及其载体构建

 根据GeneBank 中GhcelA1（U58283）序列,利用RT-PCR技术,从棉纤维中克隆到GhcelA1 cDNA全长。运用基因重组技术,构建pCAM2300-35S-GhcelA1过表达载体;融合基因表达载体pCAM2300-35S-GhcelA1-EGFP,以及pCAM2300-35S-GhcelA1-RNAi载体,这些载体均通过限制性酶切鉴定和测序验证。农杆菌介导法将融合基因转化棉花子叶,通过激光共聚焦荧光显微镜,在蓝色激发光下观察诱导的愈伤,发现在转化的活体细胞核与质膜内侧有绿色荧光,说明融合基因载体EGFP构建正确,可以在棉花中正常表达。所构建的系列载体可用于转化棉花,促进纤维素在棉纤维中合成与积累。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。     

新型vip3Aa基因的克隆与杀虫活性的测定

为了给生物防治提供更多的基因资源,以从黑龙江省分离的100株苏云金芽胞杆菌进行PCR vip3类基因鉴定,对vip3类基因进行克隆表达及生物活性测定,为vip基因储备奠定基础。利用vip3类通用引物进行基因鉴定并进行全长基因克隆表达和生物活性测定。结果表明,菌株LB73经Blast对比后发现含有vip3Aa类基因,克隆基因全长序列为2370 bp,编码789个氨基酸残基,分子量为88 kD,并在国际基因库GenBank中登记,其登录号为JQ228436,由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为vip3Aa46。构建原核表达系统,并进行杀虫活性的测定。vip3Aa46甜菜夜蛾LC50 4.02 μg/g,棉铃虫LC50 387.72 μg/g。生测结果表明,vip3Aa46表达可溶性蛋白对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力;对棉铃虫幼虫具有一定毒力。     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

GBSSI是马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶, 为培育高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料, 根据GenBank登录号X58453设计特异引物, 采用RT-PCR技术获得马铃薯块茎GBSSI相似基因, 利用生物信息学相关软件分析, 预测GBSSI相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能。结果表明, 克隆的GBSSI相似基因与报道的GBSSI基因序列相似性达到99.78%, 其开放阅读框长1 824 bp, 编码607个氨基酸, 具有许多重要功能位点;三级结构预测结果表明该蛋白具有淀粉合成功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为EU403426。以此基因CDS内542 bp的靶标序列作为干扰区段, 扩增GBSSI的正反向基因片段, 并引入237 bp的内含子序列, 构建由Patatin启动子驱动的具有“正义基因片段gbss A-内含子VP1-ABI3-like protein-反义基因片段gbss B”的植物干扰表达载体pBI121g-PgABI, 将为淀粉合成的进一步研究和高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的马铃薯品种的培育奠定基础。     

龟纹瓢虫生物学特性及其对棉铃虫捕食功能的研究

研究结果表明，龟纹瓢虫近年来田间发生量逐年增多，１９９４年６月中下旬至７月初百株累计虫量最高可达６０４头，占天敌总发生量的８９．５％，这段时间恰与二代棉铃虫发生盛期相吻合。龟纹瓢虫成、幼虫虽喜食蚜虫，但此期田间蚜虫发生量甚少，故对棉铃虫有一定控制作用，其捕食量随幼虫龄期及猎物密度增高而增多．温度１５～３５℃范围内均能正常生长发育，但发育历期随温度升高而缩短，捕食量也随温度升高而增多，捕食功能反应符合Ｈｏｌｌｉｎｇ（１９５９）Ⅱ型反应，故可用圆盘方程拟合。对于龟纹瓢虫更深一步研究，可进一步为棉铃虫综合防治提供理论依据。     

淮北地区棉田棉铃虫空间格局的时序动态

对安徽淮北棉田棉铃虫的空间分布动态规律进行了研究,结果表明,棉铃虫在棉田聚集程度基本上是随发生代次而逐渐增强的,发现不同代次虫口密度相近时理论抽样数明显不同,提出了淮北各代估值调查中的理论抽样数,并对几种空间格局模型拟合棉铃虫的空间分布情况作了比较。     

棉铃虫微孢子虫病的田间发生调查及其致病力测定

1998-2003年对棉铃虫的微孢子虫病的发生情况进行了调查,2000年田间棉铃虫为中重发生,微孢子虫病呈现发生流行的趋势,第4代幼虫感染率达到49.0%,2001年之后,微孢子虫的感染率逐渐减少。该微孢子虫只感染棉铃虫、甜菜夜蛾和菜青虫,不感染粘虫、玉米螟和家蚕。室内生测结果表明,该微孢子虫对棉铃虫具有较高的致病力,107孢子/mL的浓度接种2龄棉铃虫幼虫,16 d死亡率达到100%,接种3龄棉铃虫,16 d死亡率为87.8%,可以达到控制当代种群和压低下代种群的目的;105~106孢子/mL的浓度接种2龄棉铃虫幼虫,当代羽化率为32.2%,13.3%,下一代幼虫死亡率为88.9%,100%,可以控制下一代种群。     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。