梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库,能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料,采用Trizol法提取其RNA,利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,通过同源重组法与pGADT7载体连接,再电转化至大肠杆菌菌株。经检测,构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL,文库片段插入阳性率为100%,片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明,构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定

以四川省金堂黑山羊卵巢为材料,从其卵巢组织中提取总RNA,应用SMARTTM cDNA library construction技术,构建以真核表达栽体pGAT17-Rec为基础的黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库.结果表明,提取的RNA的A260/A280为1.95,28S与18s带浓度及亮度比值约为2.文库ds cDNA弥散较长,分布在0.2～3 kb,成瀑布条带状,而且在接近1 kh的区域有密集的条带,为高丰度表达基因.根据生长菌落计数,共获得1.6×106个转化子,文库插入片段大小约为0.1～2 kb.成功构建了金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库,为黑山羊多胎相关因子的基因筛选奠定了基础.     

大叶落地生根KdSRG1基因的克隆、表达分析及自激活检测

为探究大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana)中衰老相关基因1(Senescence-related gene 1,SRG1)的功能,以野生型大叶落地生根为材料,克隆KdSRG1基因,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位和基因表达分析。结果表明：KdSRG1基因开放阅读框为219 bp,编码72个氨基酸;KdSRG1蛋白是一个亲水性的不稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质,不含跨膜结构和信号肽,并且具有物种上的特异性;该基因在大叶落地生根的不定芽和叶中的相对表达量较高,说明其参与不定芽和叶的生长调控;通过分析其启动子顺式作用元件,推测KdSRG1基因参与植物分生组织表达和栅栏细胞分化过程,并且其表达可能受光信号、脱落酸(Abscisic acid, ABA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MeJA)调控,同时可能在植物逆境胁迫调控方面发挥作用;自激活检测表明KdSRG1蛋白没有自激活活性,可用于后续的酵母双杂实验。本研究为进一步研究KdSRG1基因的作用机制及功能奠定了基础。     

牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建酵母双杂交牛源犬新孢子虫cDNA表达文库,进而为研究新孢子虫功能结构以及为其入侵宿主致病机理研究提供良好的试验体系。体外培养牛源犬新孢子虫延边株,纯化并提取虫体总RNA,应用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。利用CHROMA SPINT+TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,文库容量为5.78×108cfu/m L,随机挑取23个单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链c DNA片段大小为400~4 000 bp,平均长度在2 000 bp左右,文库重组率为100%,此文库可用于酵母双杂交筛选。试验为筛选新孢子虫与宿主之间相互作用蛋白研究奠定了基础。     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

成人肝cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍／盐酸胍法从人肝组织中提取ＲＮＡ，通过Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维柱分离出ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板，含ＮｏｔⅠ接头的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，在逆转录酶ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔⅡＲＴ催化下合成单链ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ），再在Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ聚合酶Ⅰ与ＲＮａｓｅＨ和ＤＮＡＬｉｇａｓｅ共同作用下，ｓｃＤＮＡ拷贝成双链ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）。经放射自显影测定，合成有全长ｃＤＮＡ片段。平末端ｄｓｃＤＮＡ与ＳａｌⅠ接头连接，ＮｏｔⅠ酶切后，通过过柱取掉小于５００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，大片段ｃＤＮＡ与载体ｐＳＰＯＲＴ１连接，转化受体菌ＤＨ５α，经稀释测定出含有重组子的文库大小为３．３×１０６。该文库适合于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)蛋白质间相互的作用,本研究使用SMART技术成功构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库。首先提取PAM总RNA,使用SMART RACE法经LD PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,通过同源重组的方法将双链cDNA与pGADT7-Rec质粒共转化进酵母Y187感受态,再利用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆,最终构建的文库滴度达到了6.96×10~7 CFU/mL,重组率初步计算达到95%,插入片段范围在200~2 000bp。本研究为PRRSV致病蛋白的筛选以及相关疾病的研究奠定了基础。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。     

流产型布鲁氏菌Omp22基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

通过PCR获得流产型布鲁氏菌Omp22基因的编码区,将其克隆到pSOS载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pSOS-Omp22。测序正确后,将重组质粒导入cdc25H检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活作用,且在酵母细胞中定位是否正确。结果表明,获得了正确的流产型布鲁氏菌Omp22基因编码区,并成功克隆到pSOS诱饵载体中,且转化有诱饵载体的cdc25H在SD/Glucose(-L)营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用且其定位正确。表明pSOS-Omp22可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找巨噬细胞cDNA文库中与Omp22相互作用的蛋白质。     

应用SMARTer cDNA合成技术扩增落地生根叶片的总RNA

以落地生根(Kalanchoe daigremontiana)未长芽和长芽的叶片为材料,提取落地生根的总RNA,采用SMAR-Ter cDNA合成技术合成cDNA第1链,优化扩增第2链,通过设置梯度PCR扩增循环数,电泳分析后鉴定cDNA质量。结果表明:未长芽和长芽的材料各1μg总RNA分别成功扩增质量较高的双链cDNA。此方法的应用解决了研究材料有限的问题,可由微量的总RNA扩增出足够多的高质量双链cDNA,为进一步从基因水平研究落地生根奠定基础。     

Construction and Characterization of the Yeast Two-hybrid cDNA Library of ST Cells

To seek out proteins interact with VP2 structural protein of porcine parvovirus (PPV) in ST cell and study the molecular mechanisms of viral infection and pathogenicity, a ST cDNA yeast hybrid library was created. Firtly,the total RNA of ST was extracted using RNeasy Min Kit,and double strands cDNA was synthesized by SMART technique. Then, the ST cDNA library was successfully created by homologous recombination in yeast, the titer was 8.1×10⁸ CFU/mL, the inserts varied from 250 to 1 000 bp,the average of inserted fragments was about 500 bp,and the recombination rate was 96%.These datas indicated that the yeast two-hybrid cDNA library was successfully constructed and might be useful for screening the host proteins interacting with structure protein of PPV.     

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5'端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.1×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1190 bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.2×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1087 bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。     

日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶（Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,目前有关日本结缕草（Zoysia japonica）PPH基因的上游调控机制仍不是十分清楚,筛选日本结缕草ZjPPH1基因上游转录因子可以为延长绿期延缓衰老提供理论依据。本研究利用Clontech的SMRT cDNA合成技术构建一个日本结缕草衰老叶片的高质量全长cDNA文库,其滴度为2.0×10⁶ cfu·mL^-1,插入片段平均长度大于1 kb,cDNA片段插入重组率为100%。该文库的完整性较高,可涵盖绝大多数基因信息,为酵母单杂交筛选奠定了基础。利用酵母单杂交技术,筛选到可与ZjPPH1基因启动子片段结合的候选菌落42个,并对20个候选基因进行测序和生物信息学分析,初步筛选到6个参与细胞生长和衰老过程的重要候选基因,为进一步探索ZjPPH1基因在日本结缕草衰老和叶绿素降解中的上游调控机制提供了理论支撑。     

利用SMART技术构建羊驼皮肤全长cDNA文库

为了快速、经济和有效地寻找新基因,利用大规模测序及分析技术构建羊驼皮肤组织的基因表达谱,实验构建了羊驼皮肤cDNA文库。Trizol提取皮肤总RNA后,用SMART法构建文库：经反转录反应合成第一链eDNA,用LDPCR法将第一链产物再合成第二链和双链cDNA;经蛋白酶K和Sfi消化后,用CHROM AAPIN-400分离双链cDNA;将合适大小的ds cDNA通过16℃过夜孵育使其转入到载体中,将重组产物在22℃下用λ-phage孵育2h进行包装,制成文库。该cDNA文库的特征为：包装效率为10^6（pfu／mL）,重组率在80％以上。该cDNA文库质量可达到进行后续研究的要求。     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

青海血蜱cDNA表达文库的构建

在无RNA酶污染的环境下摘取半饱血青海血蜱唾液腺、马氏管和卵巢等器官,从中提取RNA,进而纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成青海血蜱的cDNA表达文库。经测定,所构建青海血蜱cDNA文库的库容量约为2×106PFU/mL,重组率为100%,扩增后文库的滴度为8×109PFU/mL。通过对该文库的免疫学筛选,获得一个编码青海血蜱肌球蛋白碱性轻链的全长cDNA序列。所有结果显示,青海血蜱cDNA表达文库已成功构建。