猪肺炎支原体SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速高效的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物（SX4）,建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。该方法可特异性检测Mhp,对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌4型及链球菌2型等病原均无特异性扩增;最佳引物SX4检测的灵敏度可达4.9×101 copies/μL,组内和组间变异系数均小于2%。该方法可稳定检测出工艺生产抗原和市售疫苗中的Mhp菌量。试验表明,本研究成功建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法,其特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于Mhp疫苗抗原生产和临床疫苗中的Mhp菌量检测。     

不同因素对猪肺炎支原体颜色变化单位测定的影响

为摸清猪肺炎支原体的颜色变化单位(CCU)测定是否受试验相关因素的影响,通过不同培养体系、不同种类的容器、不同的稀释方法测定猪肺炎支原体的CCU,观察培养基的变色情况,最终通过测定各组猪肺炎支原体的CCU来分析不同因素对猪肺炎支原体培养滴度的影响。结果显示,利用不同培养体系、不同容器及不同的稀释方法测定猪肺炎支原体的CCU,其结果差异均不显著(P>0.05)。该研究可为今后支原体的CCU测定提供参考。     

山羊支原体山羊肺炎亚种在2种培养基上的生长特性比较

为筛选出山羊传染性胸膜肺炎疫苗制备中抗原产量高且成本低的培养基,本试验将山羊支原体山羊肺炎亚种M1801株和M1601株接种于含20％马血清的改良Thiaucourt's肉汤(MTB)和新研制的含5％马血清的培养基(HF3),在120 h内监测其pH值、颜色变化单位(color change units,CCU)和菌体...     

猪肺炎支原体PCR诊断方法的建立

建立了一个PCR检测猪肺炎支原体(Mhp)的方法。根据国外发表Mhp 16sr RNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653bp的特异性片段。将PCR产物克隆并测序表明，与GenBank的Mhp的序列的同源性为89．2％。而对于常见的猪呼吸道疾病有关的病原胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌以及牛支原体、羊支原体不能扩增出特异性片段；PCR的敏感性实验显示这对引物能够检测到1ng的DNA，结果表明此方法特异、敏感。     

绵羊肺炎支原体最适培养基的筛选

为筛选一种适宜绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)生长的培养基,利用活菌计数方法对MoGH3-3株在改良KM2培养基、TSB-1培养基、改良Thiaucourt氏培养基和10%马血清改良KM2培养基中不同培养阶段的生长滴度即颜色变化单位(ccu)进行了测定。结果表明,在培养24,48,72和96 h,MoGH3-3株在TSB-1培养基中的平均生长滴度高于其他3种培养基。在培养的72 h和96 h,在TSB-1培养基中平均最大生长滴度达到了109 ccu/mL,在改良KM2培养基和改良Thiaucourt氏培养基中只有108 ccu/mL,而在10%马血清改良KM2培养基中仅为106 ccu/mL。这为绵羊肺炎支原体培养特性研究和疫苗生产工艺研究提供了参考数据。     

不同容积的培养瓶对猪肺炎支原体培养滴度的影响

本试验将猪肺炎支原体在不同容积的玻璃瓶中进行培养,对各自生长过程中不同时间点的颜色变化单位(CCU)和pH进行测定,分析不同容积的培养瓶对猪肺炎支原体培养滴度的影响。结果显示:与小瓶培养的猪肺炎支原体相比,万瓶的生长速度慢、CCU低、收获菌种的pH范围较广。本试验为猪肺炎支原体大规模培养和疫苗生产提供了参考。     

用PCR检测长沙市猪肺炎支原体和猪鼻支原体的感染情况

为对长沙市猪支原体肺炎病原流行病学进行初步调查,用PCR方法对从湖南省长沙市5个县（市、区）205头猪中收集的326份病料（205份猪肺和121份猪鼻拭子）分别进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分基因进行了序列分析。结果发现,猪肺炎支原体检出率为24.4%（50/205）,猪鼻支原体检出率为22.3%（27/121）;长沙市每个县（市、区）的生猪中均存在这两种支原体,其中长沙县生猪阳性率最高（42.4%和31.5%）;序列分析表明,检测出的基因序列与国内外相关序列有97%～100%的同源性。本试验证实了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在长沙市猪场的存在。     

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪肺炎支原体P36基因序列,设计1对引物,建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法,该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料,检出阳性病例18份,以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速,可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。     

猪肺炎支原体的研究进展

猪支原体肺炎是一直困扰养猪业发展的重要疾病之一。本文综合国内外对其病原一猪肺炎支原体的最新研究情况，从其对猪生长性能的影响、防治动向、检测、主要抗原的研究、基因工程疫苗研制等五个方面进行讨论。     

猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术研究

肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻,是疫苗规模化生产的工艺难题。本文针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术进行研究。通过培养试验筛选四种培养基配方表明该疫苗株在低血清改良培养基中生长良好;优化发酵培养工艺,使其在发酵罐培养60～70 h的峰值可达到1010CCU/mL;设计筛选该疫苗耐热保护剂和冻干工艺,37℃下保存10 d的耐老化试验结果显示,下降滴度小于100.5CCU/mL。本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用

根据猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的16S rRNA基因设计3条引物, 建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,并使用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。结果显示该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.66ng 的Mhp基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA,临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。该双重PCR方法,可用于Mhp与Mhr的鉴别、诊断以及疫苗纯粹性检查,快速而准确。     

猪肺炎支原体巢式PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种快速诊断猪肺炎支原体病原的方法,根据GenBank上登录的Mhp基因组序列,在保守区基因内部设计合成2对引物,经过PCR反应条件的优化,建立了检测猪肺炎支原体的巢式PCR方法。结果表明,该方法对鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;第1次扩增的敏感性是10pg,第2次扩增的敏感性是0.1pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。巢式PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以在短时间内准确快速的检测出低含量的Mhp病原,为猪肺炎支原体的快速诊断与净化奠定基础。     

猪支原体肺炎防治研究进展

<正>猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumoniaeofswine,MPS）又称猪气喘病,是支原体科猪肺炎支原体（Mycoplasmal hyopneumoniae,Mhp）引起的一种接触性、慢性、呼吸道传染性疾病,其主要表现为猪只咳嗽、生产性能降低。此外,猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）、絮状支原体（Mycoplasma fl occulare,Mfl oc）及猪滑液支原体（Mycoplasma hyosynoviae,Mhyo）也是猪群中常见的支原体科病原。     

猪气喘病的净化——猪支原体肺炎的研究进展

猪气喘病是由猪肺炎支原体引起的一种传染病。临床特征以咳嗽、气喘、呼吸困难为主，死亡率虽然低，但感染率很高，感染猪发育迟缓，生产速度减慢，加上药费的增加，给猪场造成严重的经济损失，所以净化该病就成了养猪企业一直关心的问题。本期主题将重点向读者介绍一下猪气喘病的净化措施。[编者按]     

3种定量检测绵羊肺炎支原体方法的比较

本研究采用改良Thiaucourt's培养基培养绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipleuneniae, MO)临床分离株SC01,收集不同时间的培养物,分别用颜色变化单位(CCU)法、浊度法及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法进行定量,并绘制MO生长动态曲线。CCU检测结果显示,接种后0～4 h为SC01的迟缓期,4～16 h为对数生长期,lg CCU/mL 最高达到10.7000±0.4700,16～20 h为稳定期,20 h以后进入衰亡期;浊度法定量检测结果显示,SC01培养物经过5倍浓缩后的D_{420 nm}随着培养时间延长逐渐上升,2 h时为0.0028±0.0002,4～12 h D_{420 nm}增加较缓慢,而12～24 h增加最快,24 h最高达到0.8609±0.0045,以后则趋于稳定;Real-time PCR法检测结果显示,SC01的拷贝数随着培养时间延长平稳上升,2 h时lg 拷贝/mL为4.5889±0.0048,在30 h时lg 拷贝/mL达到7.6165±0.1089。相关性分析结果表明,在迟缓期和对数生长期,CCU法与Real-time PCR法、CCU法与浊度法、Real-time PCR法与浊度法对MO的定量检测结果高度相关,相关系数分别为0.967、0.720和0.849,而Real-time PCR法和浊度法对MO的定量检测结果则在2～30 h内均高度相关,相关系数为0.912。经对检测所需时间及精确度等方面综合比较,本研究认为Real-time PCR法具有快速、准确及易标准化等特点,可以取代CCU法和浊度法用于MO的定量。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10³～10⁴倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。     

猪的微量元素锌营养研究进展

锌是目前发现的微量元素中生理功能最多的,锌参与动物体内蛋白质、氨基酸、核酸、脂肪、碳水化合物和维生素以及微量元素等营养物质的代谢,是骨骼发育、生殖、免疫、凝血、生物膜稳定等生理机能所必需。缺锌导致猪物质代谢和造血功能受阻,通常表现为贫血、骨变形、生长...     

应用荧光定量PCR筛选绵羊肺炎支原体最适生长培养基

为筛选绵羊肺炎支原体(Mo)最适生长培养基,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因FQ-PCR方法,通过检测不同培养时间各Mo培养液中Mo Y98株核酸含量,比较Mo于不同培养基中培养特性,以筛选Mo最适生长培养基。结果,以Broth-ame与TSB1培养Mo 7,10和14 d时Mo核酸检测值较高,较Frey-ame、PPLO-ame更适合Mo生长。本研究为后续Mo生物学特性分析奠定了基础。     

猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立一种针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重PCR检测方法.对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌基因组模板进行PCR特异性检测,没有任何非特异性扩增.敏感性试验显示,建立的PCR检测方法能够检测到的PCV2和Mhp模板的最低浓度分别为130和180fg·mL-1.同时用单项PCR和双重PCR对湖北省的各大猪场的174份PRDC样品进行检测,PCV2和Mhp的符合率分别达到100％和98.28％.进一步应用双重PCR调查PCV2和Mhp在不同猪场的感染动态,结果显示有一定比例的仔猪在产房就已经感染PCV2和Mhp,大部分猪是在保育和育肥阶段被感染 ;但是不同猪场表现出不同的感染动态.本试验建立了一种针对PCV2和Mhp的双重PCR检测方法,具有良好的特异性、敏感性,为临床疾病检测和疾病流行态势调查提供了有力的支持.     

猪气喘病的研究进展

猪气喘病又叫猪支原体肺炎、地方流行性肺炎,本病是由猪肺炎支原体引起的猪的一种呼吸道传染病。临床上以咳嗽和气喘为主要症状,以融合性支气管肺炎为主要病变特征。主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降,高的发病率使其严重影响养猪业的经济效益。猪喘气病流行于世界各地,在畜牧业发达的美国、澳大利亚等国普遍存在,也是对我国养猪业造成严重经济损失的主要疾病之一,