香蕉植株内生细菌群落的PCR-DGGE分析

以健康香蕉植株和感染香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense(FOC)后的香蕉植株的根茎叶组织为材料,提取样品中的总DNA,扩增细菌的16S rDNA的V3可变区,对扩增产物进行DGGE电泳分析,并对其中18条优势条带进行切胶回收、克隆测序和系统发育分析。结果表明,香蕉健株与病株各组织中所含内生细菌的种群丰富度为根部>假茎>叶片;感病植株组织内生细菌种类比健康植株丰富;BLAST结果为大部分克隆序列与已知细菌16SrDNA基因序列的同源性较高(94%~100%),分别归属于蓝细菌门(Cyanobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacterium)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和绿菌门(Chlorobi)7大类群;其中一个序列同源性较低(91%),可能代表新的分类单元。     

黄瓜根际土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE技术分析了接种枯萎病菌后黄瓜根际土壤细菌群落的动态变化。对黄瓜种植前、接菌前、接菌后发病、接菌后未发病以及接种清水(对照)共5份土壤样品直接提取其总DNA,用F338-GC/R518引物扩增16Sr DNA基因的V3可变区,结合DGGE电泳条带分析样品的细菌群落组成及变化趋势。结果显示,接种枯萎病菌后,会引起黄瓜根际土壤中细菌数量及种类发生较大的变化,其中,接种枯萎病菌后Rhodococcus phenolicus(E1)、Clostridiumsp.(E3、E6)以及3种未培养细菌(E2、E4、E5)数量增加,另外2种未培养细菌(A1、A2)数量减少。     

草莓镶脉病毒的PCR检测及特异片段的序列分析

用CTAB法从感病的草莓叶片中提取总DNA,以其为模板经PCR扩增获得与预期片段大小一致长约600bp的扩增产物,同时优化PCR反应程序,获得单一特异条带;通过总DNA浓度梯度稀释,进行PCR扩增,结果表明能检测到2.5μg叶组织中病毒的存在。回收PCR特异扩增产物,与pMD18-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。扩增片段序列与已报道SVBVCP基因序列(序列号:Nc_001725)的核苷酸同源性为89.2%,氨基酸同源性为96.3%。该特异片段序列在GenBank中的登记号为AY862389。     

利用PCR技术检测草莓镶脉病毒

 采用特异引物的PCR 扩增方法, 对30 个草莓品种进行了草莓镶脉病毒的检测, 同时用指示植物小叶嫁接法对被检植株进行了病毒检测, 两种方法结果一致。回收、克隆PCR 扩增出的特异DNA 片段,获得了携有草莓镶脉病毒CP 基因片段的载体。测序结果表明, 得到的特异DNA 片段同美国草莓镶脉病毒的株系ATCC 45058 CP 基因片段相比, 同源性为90. 94 %。     

红掌根腐病病原鉴定及其PCR 检测方法

 利用真菌通用引物ITS1 和ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列 比较,设计了1 对红掌根腐病菌的特异引物SF1/SR2,对30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和2 种 细菌基因组DNA 进行PCR 扩增。结果表明,只有红掌根腐病菌获得572 bp 的特异带。使用引物SF1/SR2 对华丽腐霉进行PCR 扩增,其检测灵敏度在DNA 水平上可达1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基 因组DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到572 bp 的特异片段,实现了对红掌根腐病菌的快 速可靠的检测。     

李ISSR—PCR反应体系的优化

本研究以田黄李叶片总DNA为材料,分析了DNA模板浓度、循环次数、退火温度和引物浓度等因素对李ISSR—PCR效果的影响。根据试验结果建立李ISSR—PCR扩增的最佳反应体系。试验结果表明,当模板DNA量为40ng,引物浓度为0．3或0．4斗M,退火温度为48．8℃,循环数为35或40时可获得较好的扩增效果。     

云南普文葡萄柚黄龙病病原分子检测及鉴定

为确定云南林科院普文林场葡萄柚试验园从美国佛罗里达州引种的葡萄柚品种是否感染黄龙病以及其病原类型,采集116个柑桔黄龙病疑似病样进行PCR检测、16SrDNA序列测定及系统进化分析。结果表明,116个样品中共有96个样品感染黄龙病,总感病率达到82.8%;在该试验园分离出的黄龙病菌16SrDNA的序列一致性达到100%,与NCBI中的柑桔黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)、柑桔黄龙病非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和柑桔黄龙病美洲种(Candidatus Liberibacter americanus)序列的相似性分别为100%、97.6%~98.5%和96.0%~96.7%。该试验园葡萄柚上的柑桔黄龙病菌属于亚洲种。     

块菌rDNA的ITS序列分析试验条件的初步研究

以我国云南和四川产的5个块菌菌株为试验材料，提取块菌DNA并对rDNA的ITS序列分析试验条件的初步研究，结果表明：运用常规CTAB法提取块菌子实体DNA．获得的DNA产量高，可以满足本试验的要求：明确了rDNAITS区域的适宜PCR扩增和克隆条件：获得4个长度为650bp、1个长度为800bp的PCR产物：将PCR产物连接到PMD18-T载体上．转4LE．coliJM109．获得了阳性克隆．供进一步序列分析用。     

平菇基因组文库的构建

本文采用原生质体裂解法制备高分子量平菇总DNA。通过Sau3A部分酶切和蔗糖密度梯度离心,获得15～25Kb平菇总DNA酶切片段。并以Lambda的衍生物EMBL3为载体,酶连形成重组DNA。然后将其包装,转染受体菌LE392,在TB平板上获得2.5×10~4个重纽子克隆。此重组子克隆群即构成中蔬10号平菇菌株基因组文库。     

葡萄根瘤蚜共生细菌分离与分子生物学鉴定

从严格密封温室的盆栽巨峰葡萄根系、寄生的葡萄根瘤蚜虫体和根际土壤中分离获得17个细菌菌株,并对其16S rDNA基因进行PCR扩增和序列分析。结果表明,17个细菌菌株16S rD-NA均扩增出1 500 bp左右的片断,通过与Genbank上已知同源性较高细菌的16S rDNA部分序列对比,初步确定了这17个细菌菌株分属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis),其中蜡状芽孢杆菌(菌株C2、R2、L2、L3、L4)和巨大芽孢杆菌(菌株L1、L4、R1、R3、C1、B1、B2、J1、J2)集中于葡萄根系和葡萄根瘤蚜虫体,而枯草芽孢杆菌(菌株T1、T2)只在根际土壤中发现,说明蜡状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌为葡萄根系和葡萄根瘤蚜的共生细菌。     

基于RAPD分析的李子新品种鉴定

以改进CTAB法对玉皇李和未鉴定新品种叶片基因组DNA的提取进行了试验。结果表明,该方法从这2个品种李树叶片中均能提出基因组总DNA,且DNA的纯度和完整性均较好,OD_(260)/O D_(280)的比值在1.8～2.0之间,无降解现象,RNA去除干净;此外,运用RAPD标记方法对这2个李品种基因组总DNA进行了PCR扩增,其RAPD分析条带清晰,用20条随机引物共扩增出114条带,平均每条引物扩增出5.7条条带,扩增片段长度为200～2000 bp,其中P_6、P_7、P_(10)、P_(14)和P_(18)5条随机引物可以单引物区分这2个品种,共获得20个条带,其中差异条带有6个,表明这6个位点存在差异。因RAPD每条扩增谱带对应基因组DNA分子上的一个位点,说明供试品种间DNA位点存在差异,表明未鉴定新品种在栽培过程中发生突变和分化,可能是1个优良种源。     

通过RACE技术构建铁皮石斛叶mRNA的cDNA PCR文库

基于RACE技术,以铁皮石斛叶片总RNA为起始材料,通过逆转录和末端转移构建出两端含有特定序列的cDNA。然后以连接有特定序列的引物进行cDNA的PCR扩增,从而构建出mRNA的cDNA PCR文库。结果表明:cDNA PCR文库的PCR效果明显高于逆转录产物的PCR效果,该方法构建的cDNA PCR文库能使cDNA放大100倍以上;以5pg的总RNA为起始材料构建cDNA PCR文库仍可得到良好的PCR扩增效果;该研究的cDNA PCR文库构建方法费用较低,操作简单,为克隆微量表达的基因提供了技术基础。     

RAPD在枇杷品种鉴定中的应用

运用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,即随机扩增多态性DNA)分析技术,对16个枇杷品种的基因组DNA进行RAPD分析,从几个随机引物中筛选出2个随机引物能从各个品种的基因组DNA扩增出DNA片段,在16个枇杷品种中2个引物扩增出19个DNA片段,其中3个为公共,16个为多态性或单态性DNA片段,表明不同枇杷品种基因型间存在着极为丰富的遗传多样性,扩增的DNA指纹图谱可将16个品种一一区分,为枇杷品种鉴定提供了新的方法,同时也为分子标记辅助育种提供了依据。     

赣南柑桔黄龙病菌16S rDNA、16S/23S rDNA间隔区和核糖体蛋白基因的遗传多样性

为探究赣南地区柑桔黄龙病菌的遗传多样性,从赣南16个县(市、区)采集32份具典型柑桔黄龙病症状的脐橙叶片样品,运用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析)技术研究柑桔黄龙病菌16SrDNA序列、16S/23SrDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因的多态性,并对3个基因片段进行测序,分析序列的碱基含量、碱基转换率与颠换率、相似性、核苷酸遗传距离和系统进化特征。结果表明,供试赣南柑桔黄龙病菌样品在3个基因片段上的RFLP指纹图谱均一致,未表现出多态性,且序列相似性均在98%~100%;序列碱基中的GC含量以16SrDNA最大,序列碱基的转换率/颠换率以16SrDNA最小;赣南柑桔黄龙病菌样品与亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus之间的序列相似性最大、核苷酸遗传距离最小,在系统进化中归属亚洲种。     

草菇ras启动子区域的克隆及其序列分析

根据Kajiwara S等报道的ras启动子的序列设计并合成一对特异引物，以草菇菌丝的总DNA为模板，通过PCR扩增，获得一条长约0．75kb片段。DNA序列测定结果表明，该片段长度为751bp。采用Blast软件和Promoter predictions软件进行启动子序列结构分析，结果表明，该片段中243-293bp和539-589bp两区域为ras启动子的基础启动子区。在283bp和579bp处有两个转录起始位点，在244～247bp和292～295bp之间有2个TATAbox，在36～39bp、377～380bp、434-437bp和716～719bp之间有4个CAATbox。此外，该片段中还含有9个Gbox、12个Ibox、2个Pbox以及3个重要顺式作用元件：ABRE元件、WUN-motif(基元)和HSE元件。     

君子兰转化酶基因片段(CMCW1)的克隆和序列分析

 分析植物酸性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以君子兰基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段，克隆入pGEM-TEasy载体，测序结果表明获得君子兰酸性转化酶基因家族的一个成员CMCW1，该基因片段长518 bp，不含内含子，编码172个氨基酸。其序列已在GenBank中登记(登记号为AY151269)。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与其它植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

金针菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从金针菇（Flammulina velutipes）7个菌株中筛选出1株高产植酸酶菌株.根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以金针菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约790bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为788bp,采用Blast软件进行序列比对发现,该片段与平田头菇（Agrocybe pediades）的植酸酶基因phy（GenBankAccession：CAC48160）编码的氨基酸具有64%的序列同源性.该片段含有2个内含子,含有植酸酶基因的活性位点高度保守序列（Active-site sequence）-RHGXRXPT.     

马铃薯栽培品种‘合作88’细菌人工染色体文库的构建与评价

以四倍体马铃薯栽培品种‘合作88’培养12 ~ 15 d苗龄的幼嫩叶片为试材,提取高分子量基因组DNA,利用限制性内切酶HindⅢ部分酶切后回收100 ~ 300 kb片段,连接到载体CopyControlTM pCC1BACTM的HindⅢ位点上,构建了细菌人工染色体（BAC）文库。该文库约由850 000个克隆组成,空载率约2.08%,保存在1 700个混合池中,克隆插入片段平均大小约为90 kb,覆盖单倍型马铃薯基因组约85倍。随机挑取6个BAC克隆连续培养5 d,提取DNA进行HindⅢ完全酶切检测,确认不同培养时间的BAC克隆的指纹图谱完全一致,表明文库较好的稳定性。BAC文库的构建为马铃薯重要农艺性状基因克隆、基因组测序以及比较基因组研究等奠定了基础。     

用rDNA-ITS方法鉴别内蒙古多种野生食用菌

采用rDNA-ITS分子标记对内蒙古地区市场11种常见野生食用菌,以2个已知长期人工栽培可食用菌种香菇和双孢蘑菇为比照进行分子鉴定;通过优化DNA提取方法及PCR反应条件,用通用引物ITS1/ITS4扩增出650~800 bp的目的 DNA片段,经PCR产物直接测序,然后与DNA序列数据库中的信息资源进行比对,鉴定出11个样品分属于卷边网褶菌、香杏丽蘑、野蘑菇、马鞍菌、杨树口蘑、蒙古口蘑和白鳞蘑菇。利用DNAMAN8软件,分析13个材料rDNA中ITS区序列,做同源性矩阵,绘制NJ树,得出13种常见食用菌亲缘关系的结论。结果表明:rDNA-ITS分析方法可以有效地划分不同种属的菌种,可以区分出常见野生食用菌。     

ISSR．PCR技术在桂花品种分类研究中的应用

 利用ISSR．PCR方法对桂花的19个品种进行了基因组多态性分析，从74个ISSR引物中筛选出13个多态性引物用于正式扩增，共扩增出9o条DNA片段，其中多态性DNA条带79条，占总扩增片段的87．8％ ，平均每个引物扩增的DNA带的数目为6．92条。根据ISSR扩增结果，应用RAPDistance软件进行Nei相似性系数和遗传距离计算，利用UPGMA法构建聚类树状图。聚类分析的结果把供试桂花的l9个品种分为8个大类，并对4个品种群的遗传关系和种下分类系统进行了探讨。