猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因的克隆和表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌溶血素(Apx)ⅣA基因的原核表达,试验采用PCR方法扩增到目的片段,并将该片段连接到pMD18-T载体中,经PCR和限制性酶切鉴定后,在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段与pET28a连接。结果表明:ApxⅣA基因测序结果与GenBank中公布的核苷酸序列的同源性达100%,说明已成功构建猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-pET28a原核表达质粒;表达质粒经IPTG诱导成功表达了36 ku的ApxⅣA原核蛋白。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组表达质粒pGEX-apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,25-4株apxIVA gene与基因库中标准7型apxIVA gene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符.apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础.     

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素单克隆抗体的制备及初步应用

据猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)apxⅣ毒素基因5'端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App 1～12血清型菌株的保守5'端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3 kDa的可溶性重组蛋白.以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体(McAb).以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞587和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1:64、1:128和1:64 000、1:128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以(NH4)2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的587单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8 μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素(rApxⅣ)的最低检出量为60 pg/mL.从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断.     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ N端基因的克隆、抗原表位的分析及表达

参照猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）ApxⅣ基因序列（AF021919）,从临床分离株2009JH扩增出1段2 427bp的序列,应用DNAstar等软件进行了序列分析和抗原表位的预测,利用PCR扩增了包含预测抗原位点的3个片段,ApxⅣ1（1～1 503bp）、ApxⅣ2（1 051～2 427bp）、ApxⅣ3（1 051～1 503bp）,并构建了原核表达载体pET-ApxⅣ1,pET-ApxⅣ2,pET-ApxⅣ3。将重组表达质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot检测。结果显示,2009JH分离株ApxⅣN端序列与参考序列（AF021919）的同源性为98.00%,与血清1型、2型和7型的同源性分别为98.23%,99.46%,98.06%。3个片段的重组质粒分别诱导表达出相对分子质量为55 000,50 000,20 000的蛋白,Western blot检测显示除20 000蛋白未检测到特异性条带外,其余有很好的反应原性。     

检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ抗体乳胶凝集试验方法的建立

采用Ni-NTA His.Bind方法纯化pET-28a-ApxⅣ2表达蛋白,以羧化乳胶为载体,经化学交联法致敏乳胶,对致敏条件优化后进行质量检测。结果显示,在pH 4.7的PBS缓冲液中,乳胶浓度为2%、蛋白质量浓度为1.5g/L,偶联8h后制备的致敏乳胶凝集反应最好,致敏乳胶抗原无自凝现象;与副猪嗜血杆菌、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌阳性血清不发生凝集;批内重复、批间重复试验很稳定;阳性血清敏感性可达1∶32。对比试验中与ELISA方法的符合率为80%,2种方法检测的结果基本相符。结果表明,试验初步建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素抗体的乳胶凝集方法,为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断提供了技术支撑。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠ、ApxⅢ和ApxⅣ的截短表达及免疫反应性鉴定

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的鉴别诊断方法,在蛋白抗原性和亲疏水性分析的基础上,设计了针对溶血外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ截短蛋白的基因扩增引物,以实验室保存的血清2型和血清5型菌株基因组DNA作为模板进行特异性基因片段扩增,分别将...     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的细菌性呼吸道传染病。Apx毒素(actinbacillus pleuropneumoniae toxin)是由胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类溶血毒素,在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中,Apx毒素起了重要的作用。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅲ A基因的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

应用PCR方法扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinabacillus pleuropneumoniae,App)编码毒素A结构蛋白的完整基因,连接到载体pMD18-T中,经Not和Snab双酶切后连接到用同样酶切的表达载体pPIC9k上,转化GS115酵母感受态细胞,经甲醇诱导表达了分泌到胞外的Apx A蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白约为110 000,与预期相符。Dot-blot和ELISA检测结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。为进一步研究Apx A蛋白的结构和功能,研制App重组诊断抗原或亚单位疫苗奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达

参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物，用PCR法扩增apxⅠA基因，获得了3069bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定和序列分析，表明克隆是成功的。再将长为1149bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N-端的片段)插入到原核表达载体pET-28(a)中，构建了重组表达质粒pET—apxⅠA，转化大肠埃希氏菌JM109(DE3)，在IPTG诱导下获得了高效表达，经SDS-PAGE检测，证实表达产物大小约为41ku。     

猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因原核表达载体的构建及其表达

经PCR从含有APXⅡA基因片段的重组质粒pT—APXⅡA中扩增出了APXⅡA基因。同时对目的基因和表达质粒pGEX-4T-1进行了双酶切，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析，证明连接向位和阅读框架正确。成功构建了APXⅡA基因的原核表达载体pGEX—APXⅡA。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS—PAGE分析表达目的蛋白。结果表明，蛋白质的分子质量为102．5ku。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清7型25-4株基因组DNA为模板，用PCR扩增外膜蛋白（OMP）基因特异片段，并克隆于pMD18-T中，经酶切及核苷酸序列分析鉴定后，亚克隆于原核表达栽体pGEX-6P-1，成功构建了重组表达载体pGEX-omp；以此转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），经SDS-PAGE鉴定，表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku，命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解，获得切掉标签的OMP。经ELISA检测，该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应，具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APP OMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠;设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1149 bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41 ku的rApxⅠA作为包被抗原,用间接ELIS...     

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV毒素单克隆抗体的制备及初步应用

据猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）apxⅣ毒素基因5′端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App1~12血清型菌株的保守5′端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体（McAb）。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞5B7和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶64 000、1∶128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以（NH4）2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素（rApxⅣ）的最低检出量为60pg/mL。从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25＿4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18＿T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX＿6P＿1中,构建成重组表达质粒pGEX＿apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS＿PAGE电泳。结果表明,25＿4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

猪胸膜肺炎放线杆菌间接ELISA检测方法的建立

【摘 要】用纯化的重组蛋白抗原作为ELISA包被抗原,通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数、酶标二抗稀释倍数、抗原和血清反应时间、血清和酶标二抗反应时间、显色剂作用时间和中止液滴加量的优化,建立了检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接ELISA方法。通过特异性实验证明该ELISA方法特异性较强。将建立的ELISA方法与IDEXX公司的标准试剂盒进行了比较,二者的符合率较高,说明建立的ELISA方法比较敏感,为ELISA检测方法的商品化奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白（OMP）5’末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。