伊氏锥虫体外培养株的建立及其HGPRT活性测定

用带虫培养法和带虫传代法建立了伊氏锥虫体外培养株，无论有、无饲养细胞，虫体均能快速增殖。培养７０ｄ以上，虫体仍保持原有生物学特性，对小鼠有感染性，活力旺盛，在体外能连续培养传代。虫数最高达２．４８×１０６／ｍＬ，群体增倍时间为８．８６～１０．８ｈ。液氮保存、复苏后的虫体可在饲养细胞上立即增殖。培养中发现由巨噬细胞转化的巨核母细胞对虫体生长有促进作用，经胰酶消化能与虫体一道连续传代。通过ＨＡＴ选择性培养液测定，伊氏锥虫对氨基喋呤不敏感，试验组虫体与对照一样生长良好，证明伊氏锥虫具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）     

水牛伊氏锥虫人工感染抗体规律及其广西地区自然感染状况的初步调查

通过实验感染,研究伊氏锥虫在水牛体内抗体及虫体消长的规律.ELISA检测结果表明,水牛感染伊氏锥虫后第6 d检出抗体,而且在2个多月的监测时间里,抗体都维持在较高水平(OD450nm>0.3),因此可利用ELISA方法对水牛感染伊氏锥虫进行早期诊断和监测;水牛感染伊氏锥虫后,即出现一个2～3周左右的虫血症峰期,然后虫血症峰期迅速下降,在虫血症峰期下降后1个多月的监测时间里,虫血症维持在一个很低的水平(≤1条虫体/视野),水牛感染伊氏锥虫后这种峰期短无明显症状、虫血症水平低的现象,给临床诊断和血液镜检虫体造成了一定的困难.对广西部分地区79份血清样品水牛检测的结果表明,伊氏锥虫抗体阳性率达到29.1%,说明广西各地水牛感染伊氏锥虫的现象普遍存在,而且感染率比较高,为了保证本地区水牛产业的健康发展,有必要对水牛伊氏锥虫感染进行有效的监测.     

应用质粒PTK探针鉴定锥虫的初步研究

用^32P标记质粒探针PTK1、PTK1.1和PTK1．2，对12株中国伊氏锥虫的斑点杂交试验显示，3个探针均能与8株具有正常动基体的伊氏锥虫杂交，而不与其余4株异常动基体伊氏锥虫杂交，对正常动基体株的敏感度为10^2虫体。探针PTK1亦能与马媾疫锥虫杂交，敏感度为10^2个虫体。但PTK1与布氏锥虫仅发生微弱的杂交反应．敏感度为10^5个虫体。试验表明伊氏锥虫株之间的kDNA微环是同源的，伊氏锥虫与马媾疫锥虫和布氏锥虫的kDNA微环存在着共同序列。     

接种泰氏锥虫及其抗原使家兔和小鼠产生抗伊氏锥虫的交叉免疫力

用培养的泰氏锥虫制备的死、活两种虫体抗原,接种于家兔和小鼠,一定时间后用伊氏锥虫强毒株攻击,观察其血清抗体的变化及交叉免疫保护能力。试验表明,泰氏锥虫虫体抗原可刺激机体产生较高的体液抗体;免疫动物有一定的抵御伊氏锥虫攻击的能力,与对照组相比,免疫动物血液中虫体出现的时间较迟,最初的数量少,临床症状轻。死虫抗原组的交叉免疫保护能力较活虫抗原组强。     

运用伊氏锥虫抗原变异规律进行免疫的初步研究

为了克服锥虫抗原变异对宿主免疫反应的干扰，探索伊氏锥虫病高效保护性抗原，根据伊氏锥虫在宿主体内第一次发生变异产生的变异抗原免疫原性相同的规律，设计了伊氏锥虫变异前抗原（VSG1）和第二次变异所产生的抗原（VSG2）复合物作免疫原，对小鼠进行免疫与单用变异前抗原免疫鼠相比较，两组鼠都用带变异前抗原的虫攻击，另以未免疫的鼠作对照，结果VSG1＋VSG2免疫组小鼠8只全部获得保护，单用VSG1免疫组小鼠10只和未免疫组小鼠10只血中全部出虫而死亡，前者比后者出虫时间和存活时间延长，提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种免疫复合物，能激收缩主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

伊氏锥虫和媾疫锥虫蛋白组分的电泳分析

应用SDS—PAGE和IEF电泳对伊氏锥虫和媾疫锥虫的蛋白组分进行了分析.在SDS—PAGE中,伊氏锥虫有21条带.媾疫锥虫有19条带,两种虫体的蛋白质区带在分子量40000～90000之间存在差异,尤其表现在表面糖蛋白上,伊氏锥虫为43000,媾疫锥虫为60000.在IEF电泳中,伊氏锥虫出现26条带,媾疫锥虫出现33条带,两种虫体的蛋白质区带在等电点4.8～5.6之间相同,而在5.6～7.0之间存在差异.本实验还对马媾疫锥虫的蛋白质进行了双相电泳分析,显示出86个多肽斑点.     

人血清中伊氏锥虫溶虫活性因子的鉴定

将伊氏锥虫在体外与人血清一起培养，虫体出现渐进性水肿，由蝌蚪形变成环形，最后崩解。将人血清注入感染鼠体内，可以清除体内虫体，使感染鼠得到保护。人血清对接种１０３个锥虫感染鼠的最小保护剂量为０．２ｍＬ，感染后５ｄ注入人血清，血中虫体数量逐日下降，至第１０天全部消失。对体外伊氏锥虫不同变异株，人血清均有同样的溶虫效果。经ＤＥＡＥ层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００过滤后，人血清中只有富ＩｇＭ的Ｆ－１有溶虫活性，而富ＩｇＧ的Ｆ－２和富ＨＤＬ的Ｆ－３均无溶虫活性，表明人血清对伊氏锥虫的溶虫活性与ＩｇＭ类天然抗体有关。另外，去补体的人血清体外溶虫活性明显减弱，而体内保护仍然有效。     

2—C—7单克隆抗体对伊氏锥虫感染力的影响

2-C-7杂交瘤细胞株对伊氏锥虫有着专一反应性。为了探讨该杂交瘤细胞株所分泌的抗伊氏锥虫单克隆抗体的生物学活性,我们观察了用单抗处理过的伊氏锥虫对小白鼠的感染力。一、材料与方法 1.杂交瘤细胞培养上清液的收集及其抗体滴度的测定复苏2-C-7细胞株并培养、收集其上清液。用ELISA法测定其抗体阳性滴度,OD值为0.87,阴性对照OD值为0.04。     

布氏锥虫马媾疫亚种体外培养的研究

用小白鼠腹腔巨噬细胞滋养层系统和无细胞培养系统成功地培养了布氏锥虫马媾疫亚种。开始建立无细胞培养系统培养时,从第6天起每日补种少量滋养层细胞系统培养的虫体,于3周内逐步建立了适应于无细胞培养系统的锥虫群体。长期连续培养两种系统培养物的虫密度均可稳定保持在7—10.O×10~5/ml左右,虫体有规律地呈岛屿状密集分布。培养液内2—ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mM和20%,添加0.1mM次黄嘌呤可使培养物虫密度增加1倍左右,用烛罐可取代CO_2培养箱。体外连续培养120天。锥虫仍保持细长形态,具表面被膜,对小白鼠有感染性。     

弓形虫,泰氏锥虫和伊氏锥虫超低温冷冻保存的试验研究

根据液氮(-196℃)超低温冷冻保存组织细胞的原理,本文选用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ号保护剂分别对来自体外培养的弓形虫和泰氏锥虫、小鼠血液内的伊氏锥虫以及小鼠腹腔液内的弓形虫进行超低温冷冻保存试验。试验表明,在没有特殊逐步降温设备的情况下,直接冻存法比间接冻存法更方便,效果更为确实。截至报道之日止,弓形虫保存已达954天,泰氏锥虫达1189天,伊氏锥虫达1089天,虫体形态、活力、增殖力和致病性均无明显改变,为虫体的长期保存提供了一较为简便可靠的方法。     

国产咪唑苯脲对小鼠和水牛人工感染伊氏锥虫病的治疗试验

应用国产咪唑苯脲,以0.5mg、0.75mg两种剂量及1、2、3 d不同疗程,对人工感染伊氏锥虫的小鼠进行了治疗试验。结果,0.75mg×2 d组连续观察15 d以上,大多数小鼠存活,而未经治疗的对照组小鼠全部死亡。对3头人工感染伊氏锥虫的水牛,以4 mg/kg剂量一次皮下注射治疗后24 h,血液压滴标本检查虫体阴性,但1周后集虫检查和小鼠接种试验均为阳性,后改用3mg/kg×2d疗法,全部治愈。另外3头人工感染伊氏锥虫的水牛,以3mg/kg×2d疗法治疗后,用血液压滴法,集虫法及小鼠接种法检查虫体均为阴性,连续观察3个月未见复发。     

泰氏锥虫体外保存时间的研究

本试验测定了泰氏锥虫的含虫血液、培养物在4℃条件下虫体的存活时间以及泰氏锥虫培养物在液氮中的保存时间,结果含虫血液在4℃环境下3日内活力不受影响,到第6日仍可培养成功,对结果影响不大。含虫培养物在4℃可保存活力15天之久。在液氮中可保存2个月或更长,     

克隆伊氏锥虫不同VAT的某些生物学特性研究

对伊氏锥虫安徽株单虫克隆ＳｈＴａｔｌ感染兔体后３、６、９和１８ｄ所分离的４个抗原变异体ＳｈＴａｔｌ．１、ＳｈＴａｔｌ．２、ＳｈＴａｔｌ．３和ＳｈＴａｔｌ．５的生长特征、对人血清敏感性和对小白鼠致病力三个方面进行了比较研究。结果表明不同抗原变异体的生物学特性不完全一致,它提示伊氏锥虫的抗原变异可能伴有虫体其它生理生化特性的改变。     

理化因素对体外培养伊氏锥虫致弱的影响

本试验观察了理化因素（γ－射线、紫外线、低浓度杀虫药）对体外培养伊氏锥虫致弱的影响，结果如下：受γ－射线辐照的伊氏锥虫开始时存活数随辐照剂量的增加而减少，随后表现出无规律性，辐照剂量５万ｒａｄ以下对锥虫的存活影响较小，５～１０万ｒａｄ辐照后２ｄ锥虫的存活数明显减少，对小白鼠的感染性消失。伊氏锥虫受紫外线照射的存活曲线为“Ｃ”型，群体抗辐射不均一，平均致死剂量（Ｄ＿（３７））为波长２６５０Ａ的２０Ｗ紫外灯离样品４０ｃｍ处照射约２ｈ。虫体照射后根据体外跟踪观察，其存活数随照射剂量的增大而减少，照射了３ｈ和４ｈ第３天的活虫数近似１００条或不足１００条，对小白鼠的感染性均消失。用０．１μｇ／ｍｌ的苏拉灭和０．８μｇ／ｍｌ的贝尼尔两种低浓度杀虫药在体外对伊氏锥虫诱导４０ｄ仅造成药敏性的改变，未造成毒力减弱。     

应用PCR扩增检测伊氏锥虫的研究

本文建立了伊氏锥虫ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增技术,并用于分裂工锥虫的检测,经ＰＣＲ增后的ＤＮＡ片断分子量约为２３７ｂｐ,可以检测到０．１ｐｇ总ＤＮＡ或１条虫体,可以诊断小鼠的早期感染（第一天）和重复感染,还可以用来考核抗锥虫药物疗效,该项技术对锥虫具有特异性,且灵敏性和准确性都很高。     

伊氏锥虫弱毒株免疫家兔的T细胞应答反应

以ANAE染色法和~3H-TdR掺入的淋巴细胞转化试验,测定了伊氏锥虫弱毒株免疫家兔的T细胞动态变化.结果,免疫兔外周血T细胞增殖反应在免疫后第24d达到高峰,ANAE阳性细胞百分率这72.65%,对照组仅为41.2%;约1周后,出现抑制性T细胞,其增殖反应也明显减弱,最后完全被抑制.而外源性白细胞介素2的加入,可解除这种免疫抑制.攻虫后,特异性T细胞应答反应未再出现强烈的回忆反应,但伊氏锥虫弱毒株免疫家兔获得9/12的保护.因此,T细胞在这种抗锥虫免疫中,没有起到主导作用.     

伊氏锥虫感染力及其毒力的比较试验

伊氏锥虫是家畜主要的致病锥虫。不但感染众多的宿主,而且地理分布也十分广泛.其感染力及毒力因地理和宿主条件的不同而表现出差异.宿主中以马、大和大小鼠等为高度易感动物,感染后往往发病急、死亡快,而牛、兔和豚鼠等动物则较差,其感染呈慢性经过.我们通过小鼠及豚鼠人工感染试验对伊氏锥虫云南株和广东株的感染力及其毒力进行了比较观察。     

梨形虫和伊氏锥虫双重PCR检测方法的建立

为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法，试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物，以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化，对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明：本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带，而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性，梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法，能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。     

泰氏锥虫抗原制备及实验室诊断研究

应用体外培养的泰氏锥虫制备可溶性抗原Ⅰ、抗原Ⅱ和代谢抗原.经测定,其蛋白含量每毫升分别为6.5mg、7.4mg和7.1mg.薄层等电聚焦电泳测定结果表明,抗原Ⅰ出现22条区带,抗原Ⅱ21条区带,代谢抗原28条区带,对照的伊氏锥虫琼脂免疫扩散抗原14条区带.经分析,泰氏锥虫抗原和伊氏锥虫抗原有4条区带在同一迁移率上.琼脂免疫扩散反应中,3种泰氏锥虫抗原均与相应免疫兔血清发生沉淀反应,抗原Ⅰ出现1条致密沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原出现2～3条沉淀线,抗原效价为1:4～16.免疫电泳显示了类似的结果,抗原Ⅰ与免疫兔血清出现1条弧形沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原与免疫兔血清出现了3条弧形沉淀线.间接血凝试验结果表明,泰氏锥虫自然感染牛血清效价为1:20～40,免疫兔血清为1:1280～5120.所制泰氏锥虫抗原对伊氏锥虫和媾疫锥虫血清也能很好地发生交叉反应,3份伊氏锥虫病马血清和3份伊氏锥虫人工感染兔血清血凝效价分别为1:10～40和1:8～1024;5份媾疫马血清有4份血凝效价为1:20～320.4份环形泰勒虫病牛血清均为阴性.     

基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%.