羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7细胞信号转导相关基因的影响

目的:从全基因组角度探索羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7细胞信号转导相关基因的影响,寻找羟基喜树碱在乳腺癌治疗中潜在的新靶点.方法:HCPT诱导MCF-7细胞,MTT法检测HCPT对细胞增殖抑制.选择40 mg/mL的HCPT作为诱导剂量组,并设置阴性对照,进行基因组芯片杂交实验.结果:HCPT对MCF-7细胞的增殖抑制作用均呈浓度依赖性,即随着HCPT浓度的增高,MCF-7的增殖受到明显抑制.HCPT诱导后,共获得了表达下调基因46个,表达上调基因9个,其中insulin-like growth factor binding protein1(IGFBP1)是表达下调(-4.010 31)最大的信号转导基因,表达上调最大的信号转导相关基因是一广谱表达基因hemoglobin2(HBG2)(+3.804 527),它在癌症发生中的作用未知.Q-PCR实验结果与芯片结果具有良好的一致性.结论:HCPT诱导乳腺癌细胞增殖抑制,可能涉及多个基因.     

ROS对氯化镉诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

为研究活性氧(ROS)对氯化镉(CdCl2)诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响,本文采用荧光探针DHR检测CdCl2诱导的MCF-7细胞内ROS的变化水平;分别采用MTT法和DNA Ladder法检测CdCl2对细胞的毒性作用和细胞DNA的凋亡情况;通过加入自由基清除剂LNAC抑制细胞内的ROS水平,从而研究ROS对细胞凋亡的影响。结果显示,1.00×10-3 mol/L的CdCl2处理MCF-7细胞6h,细胞内ROS水平为对照组的2.04倍,细胞存活率为26.54%,DNA出现片段化分解。用CdCl2+LNAC复合处理MCF-7细胞6h,细胞内ROS水平为对照组的1.25倍,细胞存活率为61.17%,DNA不出现凋亡条带。因此,由CdCl2所导致的MCF-7细胞凋亡和DNA片段化分解,与细胞内ROS水平的升高有关。     

桔黄裸伞提取物对人乳腺癌细胞(MCF-7)抑制作用的研究

采用台盼蓝法研究了桔黄裸伞的乙醚提取物、乙醇提取物和液体培养的菌丝及培养液的混合物对人乳腺癌细胞（MCF－7）的存活率和对其DNA合成的影响。结果表明：乙醇提取物对MCF－7细胞存活的抑制率达到100％。乙醇提取物和液体培养的菌丝及培养液的混合物对MCF－7细胞的DNA合成有较强的抑制作用，抑制率均达到96％以上。     

雌激素受体与细胞周期蛋白B1在乳腺癌中的表达及临床意义

目的探讨雌激素受体(ER)和细胞周期蛋白B1(cyclinB1)在乳腺癌中的表达与临床意义.方法采用免疫组化法检测70例乳腺癌组织标本中ER和cyclinB1的表达并结合临床病理情况进行结果分析.结果ER和cyclinB1的阳性表达在浸润性导管癌和浸润性小叶癌的表达差异无显著性(P＞0.05).ER和cyclinB1的阳性表达与肿瘤大小、病理学分期和淋巴结转移数目有关(P＜0.05),肿瘤愈大、病程愈晚期、淋巴结转移数目愈多则ER的阳性表达率愈低,而cyclinB1的阳性表达则相反.结论乳腺癌组织中cyclinB1的阳性表达提示预后不良,而ER的阳性表达是预后良好的标志,检测两者的表达对乳腺癌的预后判断有一定的参考价值.     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的表达

重组胸腺素alpha 1(Tα1)基因在大肠杆菌中进行表达.根据大肠杆菌密码子偏爱性合成Tα1基因并连接到pMD18-T载体上,双酶切回收的Tα1插入到pET32-α后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,经15%SDS-PAGE检测,胸腺素α1获得可溶性表达.检测到与目的蛋白相对分子量(21.8 kDa)相符的条带.重组胸腺素alpha 1在大肠杆菌中获得可溶性表达.     

DNMT1表达与乳腺癌临床预后相关性研究

为分析原发性乳腺癌中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)表达水平与临床预后的相关性。收集97例临床资料完整的乳腺癌手术切除标本,采用免疫组化SP法检测DNMT1、ERα、PR、HER-2、P53、ki-67在乳腺癌中的表达,将DNMT1表达水平与临床病理参数及随访生存状况进行相关性分析。结果发现:原发性乳腺癌组织中,DNMT1表达水平与Ki-67呈正相关,与其他临床病理参数未见相关性;低临床分期组、无淋巴结转移组、ER阳性组、DNMT1低表达组的5年总生存率和无病生存率均显著高于相应对照组,Ki-67低表达组仅5年总生存率高于相应对照组,HER-2阴性组仅5年无病生存率高于相应对照组;Cox风险比例模型分析显示:只有临床分期和DNMT1表达水平是影响总生存期(Overall survival, OS)和无病生存期(Disease free survival, DFS)的独立风险因素。表明原发性乳腺癌中DNMT1表达水平与肿瘤细胞恶性表型及患者生存时间有关,可能成为判断乳腺癌预后的一个重要指标。     

重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达

[目的]构建FMDV乳酸杆菌穿梭表达载体.[方法]从A型FMDV中克隆出VP1基因后,根据乳酸杆菌密码子偏好性对VP1进行优化,与表达载体pSIP411进行连接,并将连接产物转化到DH5α中筛选出阳性克隆菌,重组质粒酶切和PCR鉴定成功后再转化到BL21中,采用杆菌肽进行诱导表达.[结果]表达产物经SDS-PAGE和Western blottmy检测在24 kD处有明显的条带,证明VPl-pSIP411重组表达载体构建成功并在BL21中成功表达.[结论]为后续乳酸杆菌表达VP1蛋白研究奠定了基础.     

二甲双胍、罗格列酮或联合应用对乳腺癌MCF-7细胞周期和凋亡的影响

目的 观察二甲双胍单药、罗格列酮或联合应用对乳腺癌MCF-7细胞周期和凋亡的影响.方法 用浓度为20 mmol/L二甲双胍(二甲双胍组)、100 μmol/L罗格列酮(罗格列酮)及二甲双胍联合罗格列酮(联合用药组)处理MCF-7细胞48h,分别采用MTT法、流式细胞术、Hoechst33258染色法观察细胞增殖、周期、凋亡情况.结果 二甲双胍组、联合用药组的MCF-7细胞增殖被显著抑制,二甲双胍组、罗格列酮组、联合用药组阻滞MCF-7细胞于G0/G1期比例增加,S、G2/M期比例减少,二甲双胍组、罗格列酮组、联合用药组的细胞早期凋亡率分别为(15.3±1.09)％、(12.4±1.73)％、(17.2±1.63)％,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 单用二甲双胍或联合罗格列酮均能抑制MCF-7细胞的增殖,诱导其细胞周期停滞和凋亡.     

CMV启动子指导pDsRed2-1基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达

目的:为了检测扩增所得CMV启动子能够指导下游基因序列表达,从而可以为构建其它真核表达载体提供实验基础和依据。方法:对pEGFP质粒上的CMV启动子进行扩增,并将其插入pDsRed2-1质粒红色荧光蛋白上游,构建pCMV-Red质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞,对其进行荧光检测。结果:质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞48h后,荧光激发细胞,发红色荧光。结论:扩增所得CMV启动子具有启动其下游基因表达的功能。pCMV-Red质粒可用于构建其它真核表达载体。     

独角莲抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究

为探讨独角莲对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的作用,将不同浓度的独角莲根茎水提物(The aqueous extract from dried powdered rhizomes of Typhonium giganteum Engl.,AEoTGE)处理MCF-7细胞24,48,72h后,应用四甲基偶唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色试验、倒置光学显微镜观察、流式细胞术(Flow cytometry,FCM)及琼脂糖凝胶电泳法检测细胞增殖和凋亡情况.结果表明:AEoTGE能够显著抑制MCF-7细胞增殖,且在一定的浓度范围内呈时间和浓度依赖性,井可诱导其细胞凋亡.30g·L-1AEoTGE处理24,48,72h后,MCF-7细胞凋亡率分别为8.34%、12.1%和12.6%,其凋亡程度与时间呈正相关,S期(DNA合成期)的细 胞在处理72h后分布显著增加.可见,独角莲对MCF-7细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用,其抗肿瘤机制与诱导凋亡有关.     

耐盐基因Hal1的克隆及表达载体的构建

以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板,利用PCR方法,扩增出耐盐基因Hal1,测序表明该基因全长为885个核苷酸,与已发表的序列NC_001148比较,同源性99．3％。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间。构建表达载体pYES2-Hal1,序列测定完全正确,为植物表达载体的构建打下基础。     

乳腺良性病变及乳腺癌组织中基质金属蛋白酶-2、-9的表达及其意义

目的：探讨基质金属蛋白酶—2、—9(MMP—2、MMP—9)在乳腺良性病变及乳腺癌组织中的表达及意义。方法：应用免疫组化SP法检测10例乳腺良性病变及29例乳腺癌组织中MMP—2和MMP—9的表达。结果：MMP—2和MMP—9在乳腺癌中的表达明显高于乳腺良性组织。且乳腺癌患者中有淋巴结转移组MMP—2、MMP—9的表达明显高于无淋巴结转移组。结论：MMP—2和MMP—9在乳腺癌组织中有高表达且在乳腺癌细胞突破基底膜向外扩散、转移中起着重要作用，两者参与了乳腺癌的转移过程。     

猪γ干扰素基因真核重组表达质粒的构建及活性测定

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.     

重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达

目的体外拼装人抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1单链抗体(LMP1 scFv)/截断的鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine,tP)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌中诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白。方法设计融合基因LMP1 scFv/tP,在LMP1 scFv/tP的5’和3’端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点;在DNAWORKS程序指导下设计成22个相互互补的寡核苷酸序列,经PCR扩增获得融合基因LMP1 scFv/tP,再将目的基因片段亚克隆至pMD 18-Tsi mple载体中,经过酶切鉴定和测序验证。进一步将目的基因片段克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并经SDS-PAGE和western blot验证。结果各寡核苷酸片段经PCR扩增后可见明确的产物带,将获得的LMP1 scFv/tP融合基因构建至原核表达载体pET32a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。结论成功获得LMP1 scFv/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白,为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗奠定基础。     

鸡CaBP-D28k基因重组质粒构建

    为构建pCEP4-CaBP-D28k真核表达载体,根据GenBank已发表钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)设计1对引物,利用RT-PCR方法获得新扬州鸡CaBP-D28k基因序列,克隆入真核表达载体pCEP4,经PEI介导转入非洲绿猴转化肾细胞(COS-1)中,并以间接免疫荧光试验(IFA)检测CaBP-D28k表达状况.结果表明,CaBP-D28k基因核苷酸长度为789 bp,编码261个氨基酸,与GenBank上已发表序列比较,核苷酸同源性为99.9%,在第760位处存在G→T的错义突变.该序列与蟾蜍、鼠、人CaBP-D28k氨基酸同源性分别为79.7%、78.2%、78.6%;酶切和测序鉴定证实pCEP4-CaBP-D28k含有目的片段,且连接构建正确;在COS-1细胞中检测到CaBP-D28k表达.这为进一步研究pCEP4-CaBP-D28k在动物体中的表达,调控机体钙代谢奠定了基础.     

Pin1真核表达载体的构建及鼻咽癌稳定表达细胞的鉴定

目的 构建Pin1真核表达载体并筛选鼻咽癌稳定表达细胞株.方法 提取HEK293细胞RNA行逆转录,扩增Pin1基因编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA6B中,菌液PCR鉴定并测序;将成功克隆的质粒转染至CNE1细胞,杀稻瘟素筛选和Western Blot鉴定稳定表达Pinl细胞.结果 成功扩增Pin1编码区,并克隆至真核表达载体pcDNA6B中;Pin1过表达载体转染至CNE1细胞并筛选稳定表达细胞后,Western Blotting检测结果显示Pinl表达水平明显增加.结论 成功构建Pin1过表达载体并筛选出鼻咽癌稳定表达细胞,可用于后续研究.     

3-1E/mChIL-15融合基因构建及在真核细胞中的表达

将鸡堆形艾美尔球虫(E.acervulina)子孢子和裂殖子表面抗原3-1E基因片段与鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL15)通过四个柔性氨基酸SPGS连接,构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1/3-1E-linker-mChIL-15。表达质粒纯化后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光和免疫组织化学方法对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。结果表明,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后30h可检测到融合基因编码的融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达。研究为鸡艾美尔球虫基因工程疫苗进一步研制及应用奠定了基础。     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

MicroRNA-34a影响宫颈癌细胞增殖及PTEN基因表达的研究

目的探讨microRNA-34a对宫颈癌细胞增殖及抑癌基因PTEN表达的影响。方法 Hela细胞株传代培养后分为上调组、下调组和对照组,分别转染microRNA-34a模拟物、抑制物和对照物,48 h后用CCK-8、定量PCR、Western blot法检测细胞增殖及PTEN mRNA、蛋白表达。采用生物信息软件预测microRNA-34a靶基因。结果上调组Hela细胞增殖比对照组降低23.43%（P〈0.01）,而下调组比对照组增加14.77%（P〈0.01）。上调组PTEN mRNA和蛋白表达升高（P〈0.01）,而下调组表达降低（P〈0.05）。靶基因预测分析显示microRNA-34a与PTEN基因mRNA的3UTR区无互补结合区。结论 microRNA-34a抑制宫颈癌细胞增殖,可能与促进抑癌基因PTEN表达有关。     

GPC3-siRNA真核质粒载体的构建及Huh-7细胞转染

目的探讨GPC3-siRNA真核质粒载体构建并转染Huh-7细胞的可行性。方法构建真核质粒载体pcDNA3.1＋GPC3和GPC3-siRNA-1633,采用脂质体法瞬时转染至Huh-7细胞中。MTT法检测转染后Huh-7细胞的细胞活性,荧光定量PCR、Western blot分别检测GPC3 mRNA和蛋白表达。结果 GPC3-siRNA-1633基因和GPC3真核质粒载体转染Huh-7细胞后细胞存活率高,转染GPC3-siRNA-1633的Huh-7细胞出现GPC3 mRNA和蛋白表达下调。结论 GPC3-siRNA-1633可成功转染至Huh-7细胞,并抑制GPC3表达。