应用RT-PCR和病毒学方法诊断山东省鸡新城疫感染的比较研究

分别应用病毒分离和区分新城疫强弱毒株的RT—PCR技术，对山东各地疑似鸡新城疫感染的25份病料进行了实验室诊断。结果表明：从18份病料中既扩增到了新城疫强毒基因，也分离到了新城疫病毒；3份病料未分离到病毒，仅扩增到了新城疫强毒基因；4份病料分离到了新城疫病毒，但未检测到相关基因。研究表明，将RT—PCR和病毒分离鉴定两种方法相结合，可更好的满足快速、灵敏、准确的新城疫诊断要求。     

不同基因型新城疫病毒强毒株对鸡的致病性

就不同基因型新城疫病毒强毒株对鸡的致病性进行了比较。用3种基因型（Ⅵg、Ⅶd亚型、Ⅸ型）新城疫病毒强毒株分别人工感染25日龄雏鸡，结果各株病毒接种鸡均100％发病、100％死亡，表现出嗜内脏型新城疫病毒感染引起的典型的新城疫症状和病理变化。免疫组化检测发现．攻毒鸡多种组织器官中能检测到病毒抗原，在能检测到病毒抗原的器官中，病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内；新城疫病毒对肠相关淋巴组织的亲嗜性优先于附近的上皮。本试验结果表明．基因Ⅵg、Ⅶd亚型、Ⅸ型新城疫病毒强毒株对鸡均具有高度致病性。     

蛋鸡新城疫与低致病性禽流感发病特点与防控对策

<正>1非典型新城疫造成的原因新城疫病毒侵入机体咽喉部位定居和繁殖。根据机体与新城疫病毒之间力量对比,可表现为免疫、隐性感染、发病和死亡,隐性感染的鸡可不表现症状但排毒。鸡新城疫的临床表现决定于新城疫病毒的毒力和机体的免疫状态。当新城疫病毒强毒遭到免疫力降低的鸡群或新城疫病毒中毒遇到无免疫力的鸡群时表现非典型新城疫。     

强、弱毒力新城疫病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计合成NDV-V-probe和NDV-L-probe探针组和NDV-F、NDV-R引物组,以基因Ⅶ型NA-1株和基因Ⅱ型LaSota疫苗株病毒RNA作为定量检测的标准品,建立检测方法。对所建立的标准曲线进行分析,相关系数R2均为0.997,线性关系良好。通过计算变异系数CV/%分别为0.034%和0.027%,均小于1%,说明稳定性良好。对禽类常见病毒IBV、H9亚型AIV检测未发现有交叉反应,特异性好、重复性佳。结果表明:成功建立了新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR的检测方法,实现了从分子水平上快速鉴别强、弱毒力的新城疫病毒,也可快速区分野毒感染动物和疫苗接种动物,减少不必要的经济损失。     

鸡副粘病毒病病毒特性和基因型的研究及防制

用ＳＰＦ鸡胚分别从不同患病鸡群分离到４株病毒,经病毒形态、结构、理化和生物学特性、血清学等研究,本病毒为禽副粘病毒Ⅰ型,根据国际上规定三项判定新城疫毒力的标准,４株病毒均具有与新城疫病毒速发型相似的毒力,属于强毒力的毒株;人工感染７１周龄ＳＰＦ鸡均１００％发病致死;应用一株鹅副粘病毒制备的单克隆抗体获具有对禽副粘病毒Ⅰ型共同的单抗和公对鹅副粘病毒毒株和鸡副粘病毒毒株呈阳性反应,而对新城疫Ｆ１６Ｅ８     

鸭新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

为了对目前流行的鸭新城疫进行快速诊断,应用蔗糖密度梯度离心纯化后的鸭新城疫病毒免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次亚克隆后获得一株能稳定分泌鸭新城疫病毒特异性单克隆抗体的细胞株2C1.以PEG纯化后的2C1腹水为捕获抗体,辛酸-硫酸铵纯化的兔抗鸭新城疫病毒多克隆抗体为第二抗体,HRP标记的羊抗兔抗体作为酶标抗体,建立了检测鸭新城疫病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,当2C1包被量为4μg/孔,鸭新城疫病毒1:10稀释,兔抗鸭新城疫病毒多抗作用量为0.1 μg/孔,HRP标记的羊抗兔二抗1:10 000倍稀释,每次作用时间为1h时,P/N比值最高,且阳性OD值最接近1.0.试验表明,该方法特异性好,不与IBV、ARV、GPV、DPV、DHV尿囊液及H5、H9标准阳性抗原发生反应;可以检测出0.2 μg纯化病毒,比传统的HA试验的敏感性至少高64倍;批间和批内变异系数均小于10％.本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为鸭新城疫病毒的快速诊断奠定了基础.     

免疫酶斑点试验快速检测新城疫病毒

利用抗新城疫病毒特异性单克隆抗体建立了一种单克隆抗体夹心免疫酶斑点试验.用以对人工感染新城疫病毒(NDV)鸡的组织样品检测.结果表明,病死鸡的肝、脾、脑样品中 NDV 检出20/20;对 NDV 蛋白的最小检出量为9.6×10~(-9)mg/ml.此法是一种高度灵敏、特异、简便、快速的检测 NDV 的方法.     

荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒方法的建立及验证

根据新城疫病毒F基因的裂解位点序列,设计合成一对引物和TaqMan探针,以本室构建并保存的鹅源新城疫病毒ZJ1株F基因阳性重组质粒作为中、强毒力新城疫病毒RNA定量检测的标准品,建立检测方法。结果表明本试验建立的标准曲线循环阈值（Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为3拷贝/μL,对禽流感病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为中、强毒力新城疫病毒检测提供了一种快速高效的定量检测方法。对28株标准分离株强弱毒力的检测与经典病毒分离方法符合率达100%,对187份临床样品的检测,二者结果符合率接近90.0%。在新城疫病毒临床样品快速检测、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

新城疫病毒检测方法研究进展

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性、致死性传染病,被国际动物卫生组织(OIE)列为危害禽类的A类传染病之一.由于该病毒毒力存在差异,容易出现毒力返强或是导致发生非典型症状,快速、可靠、准确的诊断方法对于新城疫的监测和控制具有重要意义.本文从病毒的分离与鉴定、电镜技术、血清学方法以及分子生物学诊断技术4个方面介绍了新城疫病毒的检测技术,为今后兽医临床上检测新城疫病毒提供一定的参考.     

新城疫单抗ELISA试剂盒检测鸽新城疫病毒

用新城疫（ND）单抗酶联免疫（ELISA）试剂盒检测23例疑似ND的鸽泄殖腔棉拭样品，7份阳性样品用SPF鸡胚均会离到病毒，该病毒凝集鸡红细胞，并就抗新城疫病毒（NDV）阳性血清所抑制，其中4株病毒的MDT在48－68.6h之间，ICPI为1.55-1.85。试验结果表明所分离的病毒为NDV，亦表明ND单抗ELISA试剂盒能够检出鸽NDV，并可作为鸽群中NDV流行病学调查的有效手段。     

不同毒力和剂量的新城疫病毒感染鸡胚后固有免疫相关分子mRNA转录水平的变化

新城疫是由新城疫病毒引起的一种重要的禽类传染病,给全球养禽业造成严重的经济损失。为更好地了解固有免疫应答在新城疫病毒致病机制中所起的作用,笔者分别以不同剂量的基因VII型新城疫病毒强毒株和LaSota弱毒株感染SPF鸡胚,使用荧光定量PCR方法检测和分析感染早期的病毒增殖和固有免疫相关分子转录水平的动态变化。结果表明,强、弱毒株均可有效地激活鸡胚固有免疫信号通路,导致包括细胞模式识别受体、干扰素、白细胞介素和抗病毒蛋白等基因转录水平的变化。同一病毒以高剂量感染,较之低剂量感染后的增殖速度快,固有免疫相关基因表达上调的峰值出现得也较早。强毒株相比弱毒株诱导鸡体产生了更高水平的干扰素和白细胞介素,与强毒感染导致鸡体严重的临床症状和病理损伤相一致。总之,本研究发现,新城疫病毒感染后鸡胚固有免疫应答的速度和水平因病毒毒力和感染剂量的不同而异。基因VII型新城疫病毒可诱导强烈的细胞固有免疫炎性反应,可能是它对鸡致病性高的重要原因。     

应用新城疫单抗酶联试剂盒快速诊断鸽新城疫

某群肉鸽暴发了一种急性、烈性传染病、发病率近１００％，死亡率达４０％，发病鸽多数有呼吸症状，拉绿色稀粪，部分鸽有神经症状，病死鸽剖检表现全身充血、出血、出血性纤维素性肠炎、肺炎、气管炎等病理变化。采取病死鸽泄殖腔棉拭样品，应用新城疫单抗酶联试剂盒快速诊断，结果表明，该鸽群发生了鸽新城疫。应用典型的病毒分离、鉴定和毒力试验的新城疫诊断方法诊断，证实了试剂盒诊断结果的正确性。应用鸽源ＮＤＶ强毒作抗原制     

快速诊断鸽瘟方法的研究

从疑似鸽瘟的6例临床病例中分离到5株鸽Ⅰ型副黏病毒（SCP1-SCP5），经本实验室建立的检测中、强毒力新城疫（NDV）病毒的SYBR GREENⅠRT—PCR（RRT—PCR）方法诊断，确诊为中、强毒力新城疫毒感染，用常规RT—PCR扩增SCP1包括F蛋白裂解位点的基因片段，并进行克隆、序列测定。分析表明，SCP1编码F蛋白的基因片段裂解位点处的序列为^112K-R-^114Q—K—R-^117F，与新城疫强毒在这一区域的序列相符；与21株已报道的NDV进行核苷酸同源性比较，并建立进化树，聚类为基因Ⅵ型。     

基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。     

鹅源新城疫的生物学特性分析

对2株鹅源新城疫病毒从形态、致病力、部分F基因序列分析、动物回归试验以及病死鹅的剖检症状等方面与鸡新城疫病毒进行了比较。结果显示，2株鹅源新城疫病毒与鸡新城疫病毒应该属于同种病毒，而不是一种新病毒，只是毒力更强．且能引起鹅发病。     

新城疫病毒在全球的变异研究

自从1926年发现新城疫病毒以来，已经鉴定出Ⅰ型病毒有9个基因型和Ⅱ型病毒有10个基因型，代表着一种形式多样且不断演变的病毒。从全球的家畜流行病中一种强毒的基因型的出现及观察新城疫强弱毒的基因组序列年与年之间的变化暗示着新城疫病毒不同的基因型在全球不同的地理位置同时演变着。这巨大的基因组多样性可能会使更多的各种各样的鸟类易于受到新城疫病毒的感染以及以经常迁徙的野鸟为储藏所。     

抗新城疫病毒血凝素单克隆抗体的研制

新城疫是由新城疫病毒(NDV ) 引起的一种主要侵害鸡和火鸡的急性、高度接触性传染病, 危害极其严重.根据流行特点、临床表现和病理变化可对典型性新城疫作出诊断,但对非典型性新城疫的诊断及该病的确诊需借助于病毒的分离鉴定、血清学方法、直接病毒抗原检测等实验室手段.研制抗NDV单抗将为NDV的检测发挥重要作用,曹殿军等[1]已制备出抗新城疫病毒糖蛋白单克隆抗体,但抗NDV血凝素单抗国内少有报道,鉴此,本实验室用PEG融合技术,研制出分泌抗NDV血凝素蛋白杂交瘤细胞株.     

用反转录—聚合酶链反应快速鉴别新城疫病毒

根据新城疫病毒基因结构特点及强、弱毒株Ｆ０裂解位点的序列差异设计２对引物,建立了快速诊断新城疫并能鉴别诊断新城疫强、弱毒株的反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术。试验表明,该方法具有快速特异和操作简便等特点,不仅适用于对鸡胚毒的检测,也适用于对病鸡组织匀浆液的检测,是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。     

ELISA检测鸡新城疫病毒特异性IgM抗体的研究

以新城疫病毒单克隆抗体包被板,用10％小牛血清-PBS封闭后,捕获尿囊液中的新城疫病毒作固相抗原.在此板上应用酶标抗鸡IgM单克隆抗体进行间接ELISA试验检侧鸡血清中新城疫病毒的特异性IgM抗体.试验证明该方法特异性强、敏惑性高.兔抗新城疫病毒阳性血清可特异性阻断反应,将新城疫病IgM阳性血清用2-ME处理可使ELISA反应呈阴性,与禽源多杀性巴氏杆菌鸡IgM阳性血清、鸡传染性支气管炎病毒IgM阳性血清无交叉反应.该试验可检测到La Sota免疫后3天鸡血清中的特异性IgM,对鸡新城疫病毒IgM阳性血清的检测效价可达1:320以上,并可检测到临床新城疫病鸡血清中的特异性IgM抗体.     

基因VI型新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

鸽新城疫是严重危害鸽业健康发展的主要疫病之一,近年来流行呈上升趋势。为满足开展基因VI型鸽源新城疫病毒快速检测的迫切需求,针对国内流行的基因VI型新城疫病毒F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种可特异检测基因VI型新城疫病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了评估。结果显示,该方法与其他基因型新城疫病毒和常见禽病病毒无交叉反应,检测下限为5 copies/μL。利用该方法对临床采集的120份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果完全一致。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法特异性强、敏感性高、准确性好,可用于基因VI型新城疫病毒的快速检测。