商品肉鸭常见病的防治

<正>一、鸭瘟鸭瘟又叫鸭病毒性肠炎,是由鸭瘟病毒引起的一种急性、热性、败血性传染病。20日龄以上的鸭易感。患鸭食欲下降,饮欲增加,不愿走动,体温升高,呼吸困难,流泪,排绿色稀粪,头颈肿胀明显,故又称"大头瘟"。防治:该病目前尚无特效疗法,以预防为主。可用鸭瘟弱毒苗10日龄首免0.5羽份/只,25日龄二免1羽份/只。一旦鸭群发生该病,应立即采用高倍量鸭瘟疫苗紧急接种,注射疫苗5天内疫情基本可得到控制。患     

鸭瘟的诊断与综合防治技术

鸭瘟，又名鸭病毒性肠炎，是由鸭瘟病毒引起的鸭、鹅和其他雁形目等禽类的急性、热性、败血性传染病。鸭群感染本病后，传播迅速、广泛流行，发病率和死亡率都很高，常导致大批死亡，从而对养鸭业造成极大的危害。因此，须做好鸭瘟的正确诊断以便及时采取有效的防治措施。     

表达禽流感HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

本试验首先用RT-PCR方法扩增出H9N2亚型禽流感病的HA基因,大小约1 700 bp,将其克隆到真核表达载体pcDNA中,并将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含LacZ和HA基因表达盒克隆入马立克氏病病毒US2基因中,成功的构建了马立克氏病病毒的转移载体。然后,通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过蓝斑筛选获得重组病毒。该重组病毒通过PCR方法鉴定证实其基因组中含有完整的HA基因。免疫酶反应和Western-blot证实重组病毒表达了禽流感HA蛋白,表达的HA蛋白具有血凝活性。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

水稻全生育期稻瘟病抗性遗传及其基因定位研究

稻瘟病是最严重的世界性水稻病害之一。本实验利用高抗稻瘟病品种194—3和珍汕97B构建的重组自交系群体,通过自然诱发实验,在两个年度重复的情况下,全生育期调查水稻生长的3个关键时期一分蘖期叶瘟、抽穗期叶瘟和成熟期穗颈瘟的抗性表现,通过集团分离分析法（bulked segregation analysis,BSA）初步定位稻瘟病主效抗性基因。结果表明分蘖期和抽穗期的叶瘟、以及穗颈瘟的抗性表型频率均呈双峰分布,说明控制水稻叶瘟和穗颈瘟均表现为一对主效基因控制;全基因组分子标记分析将该稻瘟病抗性基因定位于水稻第6染色体上,处于分子标记AP22和RM19766之间。该抗性基因来源于重组自交系的抗性亲本194—3,并命名为R6。本实验为稻瘟病的持久抗性分子标记辅助选择育种和基因克隆提供了基因资源。     

直播稻品种‘旱27号’抗稻瘟病基因的定位

稻瘟病严重威胁水稻生产,利用抗稻瘟病基因选育抗病品种是防控该病的有效途径。直播稻品种‘旱27号’(H27)在辽宁地区多年来一直对稻瘟病表现高抗,但其所携带的抗稻瘟病基因并不清楚。本研究以其与感病水稻品种‘辽星1号’(LX1)为亲本杂交构建的重组自交系群体为试验材料,在田间稻瘟病诱发圃中对该RIL群体各单系对叶瘟和穗颈瘟的抗性进行鉴定,并基于水稻8K SNP芯片鉴定各单系的基因型,利用ICIMMapping 4.0软件进行抗稻瘟病基因定位。结果表明,在第12染色体14.46～14.84 Mb之间及5.49～7.74 Mb分别鉴定到1个与叶瘟抗性相关和1个与穗瘟抗性相关的QTL,其增效位点均来自‘旱27号’。本研究对北方粳稻抗稻瘟病水稻新品种选育及该病的防控具重要应用价值。     

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。     

6个抗稻瘟病基因在河南省主要稻种资源中的分布情况

明确河南省主要稻种资源中抗稻瘟病基因型及分布情况,为通过分子标记辅助选择培育抗稻瘟病品种提供参考。本研究采用6个基于稻瘟病抗感等位基因序列差异设计的特异性分子标记,对139份河南稻种资源携带的抗稻瘟病基因进行分子检测,显示河南省审定品种和外引品种中的抗稻瘟病基因较少,大部分材料仅含1~2个抗瘟基因;河南省审定品种中的主要抗瘟基因为Pi9和Pi-kh,外引品种中的主要抗瘟基因为Pib和Pi5。2016年国家品种区域试验(沿黄粳稻组)及高代品系材料中的抗瘟基因较多,分别有12和23个材料携带3个以上抗瘟基因;这两类材料的主要抗瘟基因有Pib、Pi-kh、Pi9和Pi1。总体来说,Pi9、Pib、Pi-kh及Pi5在河南主要稻种资源中的分布较广泛且大部分为纯合基因型,Pi1次之,Pi2分布最少且多数为杂合基因型。我们的研究可为河南水稻抗稻瘟病的分子标记辅助选择育种提供理论参考和指导。     

猪瘟病毒C株重组标记疫苗的构建

利用构建的猪瘟病毒C株感染性克隆作为骨架,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因作为标记基因,将GP5基因引入猪瘟病毒感染性cDNA中,体外转录得到RNA,转染SK6细胞后,检测了传代细胞中重组猪瘟病毒包含GP5区段的一段重组序列。结果表明,GP5基因稳定地插入在重组病毒基因组中,改造后的重组病毒可望作为C株活病毒标记疫苗。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因真核表达载体的构建

将麻花鸡副黏病毒ZH-1株毒种接种于11日龄SPF鸡胚,收集48～96h死亡的鸡胚尿囊液.参考已发表的鸡源副黏病毒F基因序列,设计并合成了一对特异性引物,用以扩增麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因,预期扩增的F基因片段包含完整的开放阅读框.通过RT-PCR扩增出麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因片段,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,得到F基因片段,经EcoR I和Sal I消化,将F基因克隆进入PCI-neo载体,转化大肠杆菌DHSa,挑选菌落,经限制性核酸内切酶Sal I和EcoR I双酶切及PCR鉴定,结果证明重组真核表达载体PCI-neo-F构建成功,为下一步在哺乳动物细胞vero细胞中表达打下良好的基础.扩增的F基因测序后,与其他禽副黏病毒1型F基因进行系统发育树的分析比较,为阐明麻花鸡副黏病毒ZH-1株的遗传背景奠定了基础.     

鸭瘟的综合防制措施

每年9月份至翌年4月份是鸭瘟高发季节,常有1～2只鸭先发病,七八天后或稍长时间（跟天气冷暖有关）就会感染全群,给鸭农造成巨大的经济损失。     

应用Gateway技术构建水稻OsDAD1基因的RNA干涉载体

近年来,RNA干涉广泛应用于植物基因功能研究.Gateway技术是通过采用多重载体高效构建目标基因及任何DNA片段克隆和表达载体的研究平台,该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,两端具有重组位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上.这种以重组为基础的克隆体系目前已被广泛应用于分子生物学中来分析基因的功能.本文应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了水稻基因OsDAD1的RNA干涉载体,从而证明了Gateway技术的可行性.     

水稻草状矮缩病毒P2基因多克隆抗体的制备及应用

为了进行水稻草状矮缩病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)诊断方法和蛋白功能研究。通过RT-PCR方法从感染RGSV的水稻中克隆该病毒的P2基因,并将此基因片段重组到原核表达载体pDEST17上。将重组载体转化E. coli Rosetta,经IPTG诱导后获得分子量约为29 kDa含HIS标签的融合蛋白。以诱导的融合蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到l:8192。并用制备的抗体建立了特异、灵敏的检测RGSV的IC-RT-PCR和Dot-blot ELISA方法,为该病毒的检测、诊断提供了保障,同时也为P2蛋白的结构和功能研究奠定了基础。     

SSR对黑龙江省主栽水稻品种抗瘟基因Pi-1的检测分析

应用水稻稻瘟病抗性基因Pi-1紧密连锁的3个微卫星标记RM144、RM224和MRG4766对黑龙江省49主栽水稻品种(系)进行抗瘟基因Pi-1检测分析。结果表明,用3个与抗瘟基因Pi-1紧密连锁的SSR标记同时对抗瘟基因Pi-1有检测是非常有效的途径,检测到富士光等14个水稻品种(系)含有Pi-1抗瘟基因,明确了该基因在黑龙江省水稻品种(系)中的分布情况,为分子育种、合理搭配种植品种等提供了理论依据。     

表达鸡白细胞介素18重组禽痘病毒的构建及其表达产物生物学活性的检测

为构建表达鸡IL-18的重组禽痘病毒，将含痘病毒启动子IP2EP2驱动的鸡，IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681／ChIL-18。将pSY681／ChIL-18转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IL-18的重组禽痘病毒rFPV-ChIL-18。在含有X—gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后，对重组病毒rFPV-ChIL-18又进行了多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板，利用鸡IL-18基因特异引物进行PCR，扩增出1条约0．6kb的带。收集含鸡IL-18蛋白的细胞上清液进行MTT试验，表达的产物能明显提高鸡淋巴细胞的转化率。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

巧治鸭瘟偏方四则

1．采集新鲜樟树叶捣烂后置于槽内，加入适量清水搅拌，让鸭自由采食即可。鸭瘟初发阶段能控制病情发展，连续投喂可防止复发。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制

采用RT-PCR方法扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒的外壳蛋白基因与3,非编码区,并将其构建到马铃薯X病毒(PVX)载体中.重组质粒经线性化及体外转录后接种烟草,获得含有病毒外壳蛋白基因的感病植株.感病组织可用于分子检测的质控,也可作为毒源来繁殖阳性参照物质.基于PVX载体制备的参照物质可降低检疫性病毒的生物安全风险,尤其对稳定性强、可造成严重经济损失的高风险病毒的检疫更具实用价值.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.