转基因抗虫耐除草剂(Cry1Ac+EPSPS)玉米对草甘膦耐受性研究

将具有我国自主知识产权的抗虫、耐除草剂基因转化到玉米中获得兼具抗虫和耐除草剂的复合性状转基因玉米,实现了玉米复杂性状的有效改良,研究了转耐除草剂CC-2基因和可表达Bt毒素的cry1Ac基因的双抗玉米对除草剂的耐受性及目标蛋白表达量。通过调查喷施除草剂后玉米植株存活率及株高和生长发育情况,研究了转抗虫耐除草剂基因玉米‘CC-2×BT799’、抗虫玉米‘BT799’、耐除草剂玉米‘CC-2’,以及常规玉米‘郑58’在田间对除草剂的耐受性,并用ELISA测定了供试品种中CP4EPSPS和Cry1Ac蛋白含量。对草甘膦的耐受性试验表明,转复合基因玉米‘CC-2×BT799’与单抗草甘膦品种‘CC-2’对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐施用剂量中量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。ELISA检测显示,CP4EPSPS蛋白在雄穗中的表达量较叶片稍高。且双抗品种‘CC-2×BT799’较‘CC-2’中的CP4EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量与‘CC-2×BT799’相当。在叶片中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量约为‘CC-2×BT799’的2倍。抗虫耐除草剂玉米能够有效抵御草甘膦的喷施,Cry1Ac蛋白含量在不同品种不同组织中存在差异。     

转cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799种植对土壤动物群落结构的影响

为调查转基因抗虫玉米种植对非靶标土壤动物群落结构的影响,以转cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799及其对应的非转基因对照玉米郑58为试验材料,于2014—2015连续2年在东北黑土区采用手捡法和干漏斗法分别调查大型和中小型土壤动物的类群和数量,比较分析转基因与非转基因玉米田中土壤动物群落组成和多样性,并利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)各环境因子在土壤动物群落结构形成中的作用。结果表明,郑58和转基因玉米Bt-799田中大型土壤动物总体群落组成相同,各类群多度无显著差异;2种玉米田间所有类群总体多度、物种丰富度、Simpson优势度指数、Shannon-Weiner多样性指数和Pielou均匀度指数均无显著差异,2014年其P值分别为0.949、0.867、0.751、0.998、0.985,2015年其P值分别为0.869、0.406、0.532、0.115、0.410;RDA分析表明玉米品种(系)在大型、中小型土壤动物群落结构形成中几乎没有作用。表明中短期内转基因玉米种植对非靶标土壤动物无显著影响。     

转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗虫耐除草剂玉米的田间抗性评价

为明确转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因的抗虫耐除草剂玉米的抗虫性和对除草剂的耐受性,本文通过田间人工接虫,以食叶级别、存活幼虫数、蛀孔数、隧道长度和雌穗被害级别等分别作为评价玉米心叶期和穗期的抗虫性标准,评价了转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’及同型非转基因‘ND6708’、‘ND6515’和当地‘郑单958’品种对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的抗虫效果;通过喷施除草剂后调查玉米植株的存活率,评价上述品种对除草剂的耐受性。田间试验结果表明:‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’两个转基因玉米品种对亚洲玉米螟、黏虫及棉铃虫的抗性水平均为高抗,且在4叶期和8叶期喷施草甘膦后其受害率均为0,而同型对照品种和当地对照品种喷施同剂量草甘膦后受害率为100%。综上,聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫具有较强的抗虫效果,对草甘膦具有较好的耐受性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米为主要手段的综合防治技术体系提供依据。     

转基因抗草甘膦玉米CL38-1的草甘膦耐受性及杂草化风险评价

以我国自主研制的转EPSPS基因抗除草剂玉米CL38-1为试验材料,通过抗除草剂喷施和生存竞争能力评价,研究其对目标除草剂草甘膦的耐受性以及在农田和荒地环境下杂草化的可能性。结果表明,在喷施41%草甘膦异丙胺盐水剂1 230 g/hm~2(推荐剂量)和2 460 g/hm~2(推荐剂量的2倍量)1、2、4周后,对玉米的株高及生长无不良影响,受害率为0。在农田环境下,转基因玉米CL38-1与非转基因对照郑58在生育期、株高、覆盖度、产量等方面无明显差异,在栽培地环境中可正常生长;在荒地条件下,较之杂草没有竞争优势,无杂草化风险。     

转cry1Ac基因抗虫玉米叶片残体降解对土壤动物群落结构的影响

为研究转cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799老熟叶片降解过程中对土壤动物群落结构的影响,采用凋落物分解袋法,调查了Bt-799及其对应的非转基因对照郑58和当地主栽常规品种郑单958共3个品种(系)玉米田自然条件下的土壤动物群落组成、类群丰富度和个体数,比较分析了土壤动物群落各特征参数。结果显示,共采集土壤动物42 540头,隶属6纲11目,其中Bt-799田7 481头,隶属4纲8目,郑58田8 994头,隶属5纲8目,郑单958田26 062头,隶属6纲8目,3个品种(系)在土壤动物群落组成上除少数稀有类群存在差异外,其优势类群均为蜱螨目和弹尾纲。Bt-799及其对照郑58的田间土壤动物类群丰富度、多度、Pielou均匀度指数、Simpson优势度指数、ShannonWiener多样性指数分别是3.49、138.54、0.50、0.33、0.76和3.30、166.56、0.46、0.29、0.73,均无显著差异,郑单958田间土壤动物群落各特征参数则分别是2.67、489.46、0.47、0.30、0.68,与Bt-799及其对照郑58相比只有类群丰富度和多度存在显著差异,其它特征参数均无显著差异。初步判定转基因玉米Bt-799叶片残体降解不会对土壤动物群落结构造成影响。     

抗草甘膦转基因大豆‘ZH10-6’对田间生物多样性的影响

转基因大豆新品种在商业化之前必须进行环境安全评价,其中,转基因大豆对田间生物多样性的影响是环境安全评价的重要组成部分。本研究以转G2-EPSPS和GAT双价基因的抗草甘膦大豆‘ZH10-6’及其受体大豆‘中黄10’为材料,于2019年在北京顺义地区进行了大田试验,调查了不同处理对节肢动物多样性、主要病害发生、根瘤菌及杂草多样性的影响。结果表明:与非转基因大豆‘中黄10’相比,转基因大豆‘ZH10-6’不同处理田间节肢动物物种丰富度、Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势集中性指数、Pielou均匀性指数无显著差异;大豆霜霉病与病毒病的发病率和病情指数无显著差异;根瘤数差异不显著,大豆田杂草多样性无显著差异。研究结果为抗草甘膦转基因大豆‘ZH10-6’的环境安全性评价提供了依据。     

转G2_EPSPS和GAT基因大豆栽培地生存竞争能力以及对节肢动物多样性的影响

转基因作物的全球快速发展,其对环境的安全性影响成为人们关注的热点。我国转基因大豆的发展还处于试验研究阶段,对转基因大豆环境安全性进行科学严谨评价是我国转基因大豆商业发展的有力支撑,具有非常重要的理论和实践生产意义。本研究以转G2_EPSPS和GAT双价基因抗草甘膦大豆材料GE-J16与受体材料Jack以及当地主栽品种中黄37为研究对象。采用田间栽培试验,比较其生长时期的竞争能力以及成熟期繁育和生存能力的差异,研究了转基因和非转基因大豆栽培环境生存竞争安全性;连续3年调查供试大豆品种田间节肢动物的种类与数量,分析其多样性指数、优势集中性指数、均匀性指数的动态变化,明确转基因和非转基大豆以及草甘膦除草剂对豆田节肢动物群落多样性的影响。试验结果显示,不同生育时期的3个大豆品种的株高、复叶数、田间覆盖度、繁育系数和落粒性都基本一致无差异显著性,无栽培地生存竞争优势;转基因大豆GE-J16人工除草、转基因大豆GE-J16喷施草甘膦和非转基因大豆Jack人工除草三个处理3年的节肢动物的多样性指数、均匀性指数、优势集中性指数变化趋势一致,且3个处理同一生育时期之间各指标无显著性差异,说明耐草甘膦转基因大豆以及草甘膦除草剂并不会引起豆田节肢动物群落多样性的明显变化。     

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田底栖动物群落的生态安全性

为探究转Bt基因抗虫水稻对稻田水生生物的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻华恢1号(HH1)为材料,其非转基因水稻亲本明恢63(MH63)为对照,以底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法研究了湖南湘潭转Bt水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示,2012年在HH1与MH63稻田中,分别采集到底栖动物37种和38种,二者共有物种31种,群落物种相似度为0.8267,优势种相似度为0.8235;2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物40种和41种,二者共有物种33种,群落物种相似度为0.8148,优势种相似度为0.9231;2012与2013年在HH1与MH63稻田生境中,物种丰富度、个体数量、群落多样性指数、均匀性指数与优势集中性指数的时间动态趋势一致,且均无显著差异。研究表明,连续2年稻田种植转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻HH1,在群落水平上对湖南湘潭地区稻田底栖动物无显著影响。     

转cry1Ie基因抗虫玉米对田间节肢动物群落多样性的影响

为评价转cry1Ie基因（IE09S034转化体）抗虫玉米对田间节肢动物群落的影响,采用直接观察、地面陷阱、吸虫器和空中水盆诱捕4种方法,连续2年调查了转cry1Ie基因抗虫玉米田和非转基因对照玉米田在自然条件下的节肢动物物种数和个体数,比较分析了节肢动物群落各特征参数。结果显示,2012年依次采用此4种方法调查转cry1Ie基因抗虫玉米与非转基因对照玉米田间的节肢动物群落物种数、Simpson优势集中性指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数分别为29.1、0.7、2.6、0.5,12.6、0.6、2.2、0.6,13.7、0.9、3.1、0.9和6.7、0.4、1.3、0.5,各参数之间均无显著差异。2013年调查结果与2012年一致,也显示2种玉米田的节肢动物群落各特征参数之间均无显著差异。表明转cry1Ie抗虫玉米对田间节肢动物群落多样性无显著影响。     

转cry1Ac基因抗虫棉对土壤三种酶活性的影响

为了明确转cry1Ac基因抗虫棉对土壤酶活性的影响,本研究采集转cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉‘SM 3’种植地的土壤,测定转cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉 ‘SM 3’不同生育期内根区距主根不同距离土壤脱氢酶、脲酶和磷酸酶活性的变化。结果表明,棉花根区土壤脱氢酶活性在整个生育期呈现出先升高后降低再升高的变化趋势,土壤脲酶和磷酸酶活性在整个生育期无明显的起伏变化。转基因棉‘GK 12’盛花期和枯死期根区5 cm的土壤脱氢酶活性显著高于亲本棉‘SM 3’（p<0.05）,转基因棉‘GK 12’盛花期根区15 cm和25 cm的土壤脱氢酶活性也显著高于亲本棉‘SM 3’（p<0.05）;在棉花蕾期,转基因棉‘GK 12’根区5 cm和15 cm的土壤磷酸酶活性显著高于亲本棉‘SM 3’（p<0.05）,而对根区25 cm的土壤磷酸酶活性无显著影响（p>0.05）;转基因棉‘GK 12’在整个生育期对不同距离土壤脲酶活性无显著影响（p>0.05）。上述结果初步看出,在棉花生长的一些生育时期,转cry1Ac基因抗虫棉‘GK 12’对根区土壤酶活性存在明显的影响,但其影响的程度不是很大,后期基本可得到恢复。     

转cry1Ab和epsps基因玉米对斑马鱼生长和繁殖没有影响

为评估抗虫耐除草剂转基因玉米DBN9936对斑马鱼Danio rerio的饲用安全性,本研究将DBN9936及其非转基因对照玉米DBN9858以22%的比例添加到基础饲料中饲喂斑马鱼56d,检测转基因玉米饲料对斑马鱼体长、体质量和繁殖的影响,并使用Westernblot方法检测了外源Cry1Ab和EPSPS蛋白在斑马鱼肌肉、肝脏、肠道组织中的残留情况。结果显示,转基因玉米饲喂斑马鱼56 d后,转基因玉米组斑马鱼的体长、体质量和繁殖指标与非转基因玉米对照组相比没有显著性差异,斑马鱼不同组织样品中也没有检测到外源Cry1Ab和EPSPS蛋白。56 d饲喂结果表明转基因玉米DBN9936与DBN9858非转基因亲本玉米对斑马鱼具有同样的饲用安全性,本研究为转基因玉米的安全应用提供了科学数据支持。     

转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉幼虫的安全风险评估

为评价我国自主研发的转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉Chrysoperla nipponensis幼虫生长发育的安全风险,通过将外源蛋白混入日本通草蛉人工饲料中的方法,以加入砷酸二氢钾(KH_2AsO_4)的饲料为阳性对照,研究了日本通草蛉幼虫取食后的生长发育状况。结果表明:日本通草蛉取食含Cry1Ab和EPSPS蛋白饲料的幼虫发育历期、茧期、结茧率、羽化率及成虫体重等生物学参数与取食正常饲料处理相比均没有显著差异;而取食含PAT蛋白饲料的幼虫发育历期和结茧率分别为10.7 d和96.6%,与取食正常饲料的对照11.1 d和89.9%差异显著,即饲料中添加PAT蛋白显著提高了幼虫的存活率和发育速率;取食含KH_2AsO_4饲料的日本通草蛉幼虫不能存活到茧期,说明KH_2AsO_4具有显著的杀虫活性。ELISA检测结果表明,取食了分别添加有3种外源蛋白饲料的日本通草蛉幼虫体内可以检测到相应的Cry1Ab、EPSPS和PAT蛋白,含量分别为2 758.8~5 210.7、35 018.0~54 426.6、16.8~149.8 ng/g。表明转基因玉米所表达的Cry1Ab、EPSPS和PAT蛋白对日本通草蛉幼虫没有显著的不利影响。     

非转基因抗除草剂作物研究现状与展望

抗除草剂转基因作物的培育和推广明显提高了农田除草效率,取得了巨大的经济效益。但随着研究的深入,外源基因的不可预测性却越来越多地阻碍了转基因作物的发展。针对转基因作物与非转基因作物的优缺点,该文系统地综述了国内外抗除草剂作物的研究现状,重点阐述了非转基因抗除草剂作物的主要研究方法及存在的问题,并提出研究对策和发展方向。     

转cry1Ac+cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。     

抗草甘膦基因的克隆及在原核表达系统中的功能分析

为了克隆抗草甘膦基因并在原核表达系统中分析其抗性水平,利用200 μmol/L草甘膦平板从草甘膦严重污染的土壤中筛选到1株抗草甘膦菌株G6PP,经电镜和16S rDNA鉴定为恶臭假单胞菌;以该菌株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增出5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(EPSPS)基因,该基因编码440个氨基酸,亚克隆到原核表达载体pEET-28a中构建原核表达载体pET-G6;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导,表达出46 ku的融合蛋白;携带pET-G6质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在液体M63培养基中能耐受150 μmol/L草甘膦的抑制.本研究结果表明克隆到的G6基因具有一定的抗草甘膦活性,对抗草甘膦作物的培育具有实践意义.