猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病毒均为阴性;灵敏度高,所建立的CSFV-RT-LAMP方法灵敏度为10-5,总RNA的检测阈值约为1pg;反应快速,整个扩增反应可在1h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法,可以满足基层检疫的需要。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

禽流感病毒RT-LAMP检测技术的建立

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)M基因序列,设计针对所有亚型AIV的通用检测引物,并对反应条件进行优化,建立了检测AIV的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)可视化检测方法。结果表明,建立的检测方法对禽流感病毒总RNA最小检出限为10fg,灵敏度为RT-PCR的1 000倍,能特异地检测出所有不同的HA亚型禽流感病毒,对其他禽呼吸道病原体无扩增反应;本方法快速,在常规水浴锅或金属恒温槽中50min就可完成,反应结束后不需开盖即可直接用肉眼根据反应液的颜色变化对结果进行判定。本研究建立的禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法具有操作简便、仪器设备要求简单、灵敏、快速、特异等优点,适合在基层进行AIV的快速早期筛检。     

罗斯河病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank中收录的罗斯河病毒(RRV)基因序列,以其保守的E2基因为靶序列,设计并筛选出一套特异性LAMP引物;通过优化反应条件,最终建立了RRV RT-LAMP检测方法,并对其灵敏度、特异性进行了验证。结果显示:本方法对RNA样本的最低检测限可达10拷贝/25μL,而荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的灵敏度分别为10拷贝/25μL、100拷贝/25μL;其特异性良好,不与同属或相似病毒发生交叉反应。结果表明,本方法灵敏、特异、快速、便捷,可应用于我国虫媒病高发区的RRV筛查预警。     

非洲猪瘟病毒LAMP可视化快速检测方法的建立与应用

旨在建立一种适用于现场快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的可视化环介导等温扩增(LAMP)方法.采用针对非洲猪瘟病毒的p72基因编码区序列,设计合成2组引物,对引物进行筛选和反应条件优化,确定敏感性与特异性,并与荧光定量PCR方法进行比较.结果:建立的LAMP方法在63℃50 min内对ASFV的检测灵敏度为10 cop...     

小反刍兽疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)建立了小反刍兽疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据小反刍兽疫病毒N基因保守区域设计的LAMP引物能够在63℃恒温下,1小时内实现目的核酸的大量扩增,由于在检测前加入荧光指示试剂,检测结果可以直接用肉眼判断,避免了由于开盖检验带来的扩增产物污染导致的假阳性。该检测体系具有较高的特异性,只能特异性地检测目的病毒,与其他同属的病毒或类似病毒等无交叉反应;具有较高的检测灵敏度,比普通RT-PCR灵敏性高10倍,与荧光RT-PCR的灵敏度相当。     

非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速简便、灵敏度高、准确性好的非洲猪瘟病毒恒温快速检测方法,根据ASFV P72基因保守区域设计特异性引物,优化引物浓度、反应温度、反应时间,建立了一种基于SYTO9荧光染料的非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP快速检测方法。结果表明,该方法在63℃条件下扩增40 min,该方法灵敏度高,最低可检测限为10 copies/μL;特异性良好,与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应;重复性好,变异系数低于5%。对70份临床样本检测,4份血液样品和9份脾脏样品检测阳性,与荧光定量PCR检测结果符合率为100%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好、符合率高,适用于非洲猪瘟现场快速诊断。     

牛呼吸道合胞体病毒RT-LAMP检测方法的建立

牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是引起牛呼吸道疾病的一种病毒性病原体。本研究建立一种利用环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测BRSV的新的方法,针对BRSV N基因(GeneBank:AF054668.1)设计4对特异性LAMP引物,每组引物特异性识别靶基因序列上4个独立区域,利用扩增靶DNA的Bst2.0 DNA聚合酶,63℃恒温水浴50 min完成病毒检测,使用钙黄绿素检测荧光目视和琼脂糖凝胶电泳方法,同时对牛的其他主要病毒进行特异性检测,结果证明特异性好。该RT-LAMP检测方法的灵敏度达到BRSV模板稀释的10~(-6)倍,可成功检测到临床样本中的BRSV基因组,为BRSV的临床检测提供了一种快速的试验手段,更适合BRS的诊断和临床现场快速检测。     

非洲马瘟病毒、西尼罗病毒和马冠状病毒的基因芯片检测技术研究

为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为10²拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为10⁴拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。     

非洲马瘟概况综述

介绍了非洲马瘟病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断及疫苗研究情况,分析了非洲马瘟防控现状,提出了防控非洲马瘟的目标及措施,为我国防范非洲马瘟疫情提供依据。     

非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲马瘟病毒（AHSV）S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒（BTV）、马流感病毒（EIV）、马动脉炎病毒（EAV）等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×101 copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。     

非洲马瘟间接ELISA方法的建立及初步应用

为建立检测非洲马瘟间接酶联免疫吸附试验方法,利用重组杆状病毒感染昆虫细胞表达出具有良好抗原性的VP7蛋白,将感染VP7重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液作为包被抗原,通过优化包被抗原浓度、二抗稀释度等,建立了检测非洲马瘟的间接ELISA方法,并进行了初步运用.结果表明,直接利用真核细胞表达VP7蛋白的昆虫细胞裂解液作为包被液可成功建立检测非洲马瘟的间接ELISA方法.     

非洲马瘟病毒VP7蛋白研究进展

非洲马瘟(African horse sickness, AHS)是由非洲马瘟病毒(African horse sickness virus, AHSV)引起的一种通过库蜢等昆虫传播的、主要感染马科动物的传染病。我国是世界动物卫生组织认可的非洲马瘟无疫国,随着AHS疫情在东南亚的传播,增大了疫情传入我国的风险。AHSV编码了7种结构蛋白(VP1～VP7),其中VP7是病毒内衣壳蛋白的主要组成部分,在AHSV 9个血清型中高度保守,常作检测的靶标。此外,VP7蛋白的自组装特点对于AHSV亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗(VLP)的研究有基础性作用。对当前AHSV VP7蛋白相关研究进展进行了综述,以期为AHSV检测方法及疫苗等研究提供参考。     

非洲马瘟疫苗的研究进展

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)由非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)感染马科动物而引起的一种非接触性传播的虫媒病毒病,为世界动物卫生组织法定报告的动物疫病,目前主要流行于亚撒哈拉非洲等地区。库蠓(Culicoides midges)是非洲马瘟的主要媒介昆虫,其在疫区的生长繁殖直接影响着该病的流行状况。非洲马瘟弱毒苗和灭活苗已经商品化并得到广泛地应用,新型基因工程疫苗,如亚单位疫苗、活病毒载体疫苗等,正在研发当中并有望将来进入疫苗市场,作者着重对ASH疫苗的研究现状进行了评述。     

非洲马瘟疫苗研究进展

本文对非洲马瘟的病毒特性、临床症状和检测方法进行概述,重点对非洲马瘟的传统疫苗和新型疫苗的研究进展进行了详细综述,以期为非洲马瘟疫苗的相关研究提供参考。     

施马伦贝格病毒RT-LAMP检测方法的建立

通过对施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)及其同属各病毒基因序列进行比对分析,设计了针对SBV S基因节段的一组6条特异性引物,经优化建立了SBV RT-LAMP检测方法,可在63℃恒温条件下,于50min内完成目的序列扩增,通过染料法和琼脂糖凝胶电泳法观察结果,其灵敏度可达10TCID50,与荧光RT-PCR方法具有相同的敏感性。特异性试验显示,本方法与同属的沙门达病毒(Shamonda virus)会发生交叉反应,需借助沙门达病毒S基因节段上的一个特异性酶切位点Afl II进行酶切,实现两者的鉴别诊断。对103份临床样品的检测结果显示,本方法与荧光RT-PCR方法符合率为100%。本研究建立的RT-LAMP方法快速、简单、灵敏度高,不仅适用于实验室鉴定,还可应用于口岸、野外等的临床大规模监测。