南瓜基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)文库的构建

[目的]构建南瓜基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)文库。[方法]以南瓜幼芽为材料,利用HindⅢ酶切体系,初步构建南瓜基因组DNA的BAC文库。[结果]研究成功构建了南瓜基因组DNA的BAC文库。[结论]该技术为南瓜相关基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等研究工作奠定了基础。     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

关中奶山羊BAC文库构建条件研究

BAC(bacterialartificialchromosome,细菌人工染色体)是一种新发展起来的构建高等生物基因组文库的重要方法。由于关中奶山羊产奶性能好,成为制备乳腺生物反应器的理想动物之一,故对关中奶山羊BAC文库的构建条件进行了研究。用BamH 部分酶切关中奶山羊的基因组,用CHEF(箝位匀强电场)凝胶电泳分离大片段DNA,以电透析法回收DNA后,与酶切脱磷的pBeloBAC11载体连接,然后电激转化感受态细胞DH10β,得到了数千个阳性克隆,插入片段平均为30～40kb。在此过程中摸索了BAC载体制备、高分子量DNA制备、酶切、连接和电激转化等一系列环节对高效转化产生大片段DNA克隆的影响。     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

以P30A细胞质雄性不育系黄化苗为材料,采用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提取棉花线粒体,低熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体DNA(mtDNA),经BamHⅠ,HindⅢ酶切和PCR扩增进行纯度鉴定,并对其进行部分酶切,酶切片段与载体连接,电击转入大肠杆菌DH10B中,成功的构建了棉花线粒体基因组BAC文库。该文库共挑取3 840个单克隆,平均插入片段大小为15.5 kb,覆盖率超过70倍,研究结果表明该基因文库具有较高的质量。     

重叠延伸PCR-酶切连接法构建链霉菌表达载体

在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(...     

奶山羊细菌人工染色体基因文库构建的初步研究

细菌人工染色体(BAC)文库是进行动物基因组学研究的一个重要手段,为配合山羊乳腺生物反应器的研究,对构建山羊基因组BAC文库进行了初步研究。用H indⅢ酶对莎能奶山羊基因组进行部分酶切,用CHEF(箝位匀强电场)二次电泳法回收150 kb大小条带,电透析回收高分子量(HMW)DNA;同时以BAC载体pB eloBAC 11为材料,分别采用限制性内切酶H indⅢ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,将该载体自连并通过凝胶回收线性段DNA,获得了可用于构建BAC文库的线性载体。将HMW与载体进行连接,电击转化感受态DH 10β大肠杆菌,一次转化得到近2 000个克隆。插入片段大小为50~200 kb,基本满足建库的需要。     

赤点石斑鱼微卫星DNA的筛选

提取赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)基因组DNA,经BamH I和Hind III双酶切并电泳回收300~1 000 bp的片段与经BamH I和Hind III双酶切的pUC18质粒重组,转化感受态大肠杆菌JM109,以α互补法筛选重组阳性克隆,建立赤点石斑鱼部分基因组文库。应用PCR混合池法筛选含核心序列为(CA)n和(GA)n微卫星位点的阳性克隆,经DNA测序,得到61个含微卫星序列的克隆,占总克隆数的2.89%。61个用于测序的克隆中共有111个不同类型的微卫星序列,其中(CA/TG)n重复类型57个,占51.4%;(AG/TC)n重复类型35个,占31.5%;其他重复类型19个,占17.1%。完美型、非完美型及复合型序列分别占48.7%、41.4%和9.9%。并在GenBank上注册了22个微卫星序列。     

番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建

利用宏基因组DNA提取试剂盒提取番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组DNA,经PstⅠ和HindⅢ双酶切,回收1-5kb大小的片段,与经过相同酶酶切的PblueScriptⅡKS（＋）质粒载体相连接,转入大肠杆菌DH5a,构建了番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组文库。     

生长抑素基因初级克隆质粒（pUC12—SS）的改造与鉴定

生长抑素(somatostatin,ss)基因初级克隆质粒(pUC12-SS)含有限制性内切酶BamHI和HindⅢ的重复位点,用HindⅢ酶切处理和T_4DNA连接酶连接后。获得了它们的单一位点。并对经过修饰后的质粒进行了多个酶位点、SS基因片段回切和DNA序列等全面分析和证实。     

基于DNA条形码的武夷光唇鱼物种有效性

本研究以线粒体COI基因全序列为分子标记分析了台湾光唇鱼(Acrossocheilus paradoxus)和武夷光唇鱼(A. wuyiensis)的物种有效性。光唇鱼属6个种76尾样本的COI基因全序列共获得21个单倍型,采用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建的系统发育树表明,台湾光唇鱼和武夷光唇鱼构成单系群。K 2-P遗传距离分析显示台湾光唇鱼与武夷光唇鱼之间平均遗传距离仅为0.853%,远小于COI条形码在物种间的2%遗传距离阈值。以ASAP物种界定法分析结果显示台湾光唇鱼和武夷光唇鱼为同一物种。因此,闽江分布的武夷光唇鱼与台湾光唇鱼应为同一物种,武夷光唇鱼为台湾光唇鱼的同物异名。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

1材料与方法 1．1菌株供试拮抗链霉菌共10个菌株,均由该课题组分离自京郊菜田土壤和天然次生林土壤（表1）。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the preparation method and amplification system of antagonistic streptomyces DNA templates based on AFLP assays, and also provide a basis for the application of AFLP technology in the analysis of streptomyces or even actinomyces. [Method] The DNAs were extracted by the modified CTAB method and amplified by the Pst Ⅰ/Mse Ⅰ AFLP kit and its reaction system. The amplified products were analyzed by the denatured polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The genomic DNAs of ten antagonistic strains of Streptomyces were extracted and tested. The result of 0.8% agarose gel electrophoresis showed that the major DNA bands were clear without degradation and RNA residue, with the fragment sizes ranging from 37.64 to 40.86 Kb. By ultraviolet spectrophotometry, the OD260/OD280 values varying from 1.625 to 1.833 were obtained. Furthermore, the agarose gel electrophoresis of DNA products digested by Pst Ⅰ/Mse Ⅰ presented the dispersed fluorescent long band, which indicated that the enzymatic hydrolysis was fully carried out. The amplified bands of DNA templates by the screened three pairs of primers were clear with rich polymorphism. [Conclusion] The preparation method and amplification system of DNA template established in this study can be used in the AFLP analysis of Streptomyces.     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系,为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA,利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增,采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰,片段大小为37.64-40.86Kb,无降解现象,亦无RNA残留;其OD260/OD280为1.625-1.833;Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带,说明酶解充分;筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰,多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。     

Method for Isolating Mitochondrial DNA from Etiolated Tissue of Cabbage

Isolation of high-quality mitochondrial DNA（mtDNA） is an important premise for researching molecular mechanisms in cytoplasmic male sterility of cabbage（Brassica oleracea L.var.capitata）. An efficient protocol for separation and purification of mitochondria and extraction of mitochondrial DNA（mtDNA） from etiolated tissues of cabbage was developed. We took a method combined mannitol density gradient with differential centrifugation, selected appropriate rotational speed, extended DNase I treating time and changed mitochondria cracking condition. The results showed that the extracted mitochondria in this protocol had complete structure, appeared to ellipsoid and had not been contaminated with other impurities under the Jannus Green B staining. The isolated mitochondrial DNA had high purity and yield through detecting the optical density, nuclear specific primer PCR and agarose gel electrophoresis. The results indicated that mitochondrial DNA extracted by this protocol had high quality and enabled to be used in futher genetic studies.     

4种思茅松总DNA提取方法的比较

以思茅松(Pinuskesiyavarlangbianensis)针叶为材料,分别采取了简易提取法、高盐沉淀法、CTAB沉淀法和高盐低pH法提取基因组DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶处理和RAPD3种方法对所提取的DNA样品进行检测,将它们在DNA产量、质量等方面的优缺点进行总结,并根据群体分子遗传学研究工作的实际特点确定了高盐沉淀法为最佳方法     

弗氏链霉菌变种S-221所产生物活性物质对细菌、霉菌及酵母类抑菌效果的初步研究

弗氏链霉菌变种S-221的摇瓶发酵液用无水乙醇提取,制备成弗氏链霉菌变种S-221生物防腐剂200倍稀释液,分别在牛肉膏蛋白胨培养基平板上测定了5种不同的细菌,在马铃薯葡萄糖培养基平板上测定了5种霉菌和3种酵母菌。除大肠杆菌的抑菌效果为94.2%和金黄色葡萄球菌的抑菌效果为98%以外,其余菌的抑菌效果达到100%;对制备好的平板暴露在空气中自然接种微生物的抑菌效果也达到100%。     

弗氏链霉菌变种S-221所产生物活性物质抑菌活性的初步研究

利用无水乙醇分别从弗氏链霉菌变种S-221摇瓶发酵液的上清液和菌丝体中提取生物活性物质,分别对不同细菌、酵母菌和霉菌进行抑菌活性的测定。结果表明,上清液和菌丝体的乙醇提取液对蜡质芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、啤酒酵母、木霉、毛霉、黑曲霉均有较强的抑菌活性。     

两种检测扁桃基因组RAPD扩增产物方法的比较分析

通过2;(w/v)的琼脂糖凝胶和8;(w/v)的聚丙烯酰胺凝胶电泳对扁桃品种基因组DNA的RAPD检测.结果表明:8;(w/v)聚丙烯酰胺凝胶优于2;(w/v)琼脂糖凝胶,主要表现在,8;聚丙烯酰胺凝胶对长度相差100 bp以下的DNA分子的分离较2;的琼脂糖凝胶电泳效果好;且8;聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围广,在线性DNA分子(0.1～2.0 kb)范围内也能得到很好的分离效果;用8;的聚丙烯酰胺凝胶分离扁桃品种基因组DNA的RAPD扩增结果,表现出在扁桃品种间DNA水平上差异大,运用此方法提高了扁桃品种的鉴别能力.     

吸水链霉菌桂林新变种的分类研究

从广西桂林的土壤中分离到一株链霉菌（编号为２３４５），它的发酵产物对线虫、菜青虫、松毛虫等畜禽寄生虫及作物害虫等的防治效果显著，它对一些格兰氏阳性菌也有明显的抑制作用，对其进行分类学研究的结果如下：按照链霉菌的分类法，该菌细胞成份属于细胞壁Ｉ型，糖Ｃ型。该菌在高氏培养基、ＩＳＰ－４等培养基上产生丰富的孢子，在斜面上则呈现一片褐色斑。该菌在培养特征、碳源利用以及形态特征等方面均近似于淡紫灰吸水链霉菌，但对淀粉利用能力很强。另外，它对枯草杆菌、藤黄八叠球菌等阳性菌的抗菌作用强，尤其是它的发酵产物可以杀死禽畜体内的线虫，故属淡紫灰吸水链霉菌桂林变种Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕｌｏｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｖａｒ．ｇｕｉｌｉｎｎ．Ｘｉａ．