三种猪的肠道腹泻冠状病毒三重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了同时检测引起猪只腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪急性腹泻冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)这三种主要肠道冠状病毒,试验设计3对特异性引物,建立PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重RT-PCR方法,同时进行特异性、敏感性、重复性试验,并检测临床样品对方法进行验证。结果表明:采用建立的三重RT-PCR方法对PEDV、PDCoV和SADS-CoV进行扩增,分别扩增出大小约为486 bp、329 bp和628 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪传染性肠胃炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不能扩增出任何片段,特异性好;对PDCoV、PEDV和SADS-CoV的最低检测量分别为1×10~6,1×10~3,1×10~4 copies/μL,具有较好的敏感性;在196份临床样品中,PEDV的阳性检出率为13.27%,PDCoV为12.24%,SADS-CoV为0,同时多重RT-PCR与单项RT-PCR检测方法的符合率均为100%。说明建立的三重RT-PCR方法能够同时特异敏感、高效廉价检测出猪群中PDCoV、PEDV及SADS-CoV这三种肠道冠状病毒,具有快速、便捷和经济的特性,可用于临床大规模流行病学调查和诊断。     

猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法的建立

已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通用荧光定量PCR检测方法。依据NCBI公布的这6种猪冠状病毒序列，利用MEGA软件进行全基因序列比对，通过分析在ORF1b中找到1段长为196 bp的保守序列，设计兼并引物，建立了用于检测猪冠状病毒的通用荧光定量PCR检测方法；结果显示，该检测方法能扩增出6种猪冠状病毒，对PDCoV、PRCV、PHEV、SADS-CoV、TGEV的灵敏性均可达到10¹拷贝/μL,对PEDV的灵敏性可达到10⁰拷贝/μL;与CSFV、PRRSV、PPV、PCV、PRV无交叉反应，特异性良好；组内和组间变异系数均小于2.2%,重复性良好。利用建立的检测方法对62份病料进行检测，检测出27份样品呈现猪冠状病毒阳性，而利用普通RT-PCR方法共检测出24份阳性样品。选择2份猪冠状病毒阳性样品进行克隆测序，在NCB...     

应用套式PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的S基因核苷酸序列，设计合成了2对引物，以猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒细胞培养物为模板，进行PCR特异性片段扩增，猪传染性胃肠炎病毒扩增片段大小为886bp，猪呼吸道冠状病毒扩增片段大小为214bp。建立的套式PCR经过特异性、敏感性试验及对临床送检样品检测，证明本法具有快速、特异和高度敏感的特点。     

应用套式PCR方法检测猪圆环病毒2型

根据Genbank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计2对PCV2特异性引物,建立套式PCR检测方法。外测引物p1、p2扩增片段长度为647bp(92-738),内测引物p3、p4扩增长度为219bp(319-537)。其中用外部引物可扩增DNA含量到10-5mg/mL,而套式PCR则比普通PCR灵敏性还要提高103倍。用该方法对山东、安徽和河北10省的899份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有329份样品检测出阳性,平均阳性检测率达36.6%。由此可见,PCV2感染在全国范围内的发病猪群中普遍存在。     

猪急性腹泻综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种鉴定猪急性腹泻综合征病毒（SADS-CoV）的RT-PCR方法,根据NCBI登录的SADS-CoV N基因保守区域序列,设计了3对引物（P1、P2和P3）,通过对SADS-CoV及其他6种病毒进行检测,筛选出最合适的引物,然后对退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、rTaq DNA聚合酶浓度和循环次数等反应条件进行了优化。结果显示,P3引物对SADS-CoV特异性最好,与其他病毒无交叉反应。敏感性试验显示,该方法最低检测限可达9.55×102 copies/μL;重复性试验显示该方法重复性良好。运用建立的RT-PCR方法,对广东省的21份临床样品进行检测,结果检出SADS-CoV阳性样品4份,阳性样品的测序结果与其RT-PCR完全一致。结果表明,本研究成功建立了一种鉴定SADS-CoV的RT-PCR方法,且该方法具有检测快速、成本廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可以用于SADS-CoV的临床诊断。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应。敏感性试验显示,该PCR方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝。此外,应用该方法对湖北、湖南、河南省的各大猪场进行了流行病学调查,在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。其中,对4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95%,并显著高于非腹泻猪群(47.83%)。本研究调查结果显示PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用

为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RT-LAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初步建立SADS-CoV的RT-LAMP快速检测...     

猪德尔塔冠状病毒纳米PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)毒株M基因设计特异性引物,建立了PDCo V纳米PCR检测方法并进行了临床样品检测。结果显示:该方法对标准品检测的最低浓度可达102 copies/μL,与其他几种常见猪病病毒无交叉反应;用该方法检测国内猪场62份腹泻粪便样品,相比常规PCR方法,该纳米PCR方法的检出率更高,而两种方法对268份进境活猪粪拭子样品检测均为阴性。结果表明,本研究所建立的纳米PCR检测方法适用于国内猪场的PDCo V检测和进境活猪的监控检测,可作为PDCo V实验室检测的有力技术手段。     

猪源冠状病毒监测简报

目前,已知感染猪群的冠状病毒有6种,分别是猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)和猪δ冠状病毒(PDCoV)。在冠状病毒科α、β、γ、δ等4个属中,PEDV、TGEV、PRCV、SADS-CoV均为α冠状病毒,PHEV为β冠状病毒,PDCoV为δ冠状病毒。PRCV在临床上引发仔猪呼吸道症状,PHEV感染会造成仔猪呕吐和神经症状,其他4种病毒均可引起猪群腹泻。中国动物卫生与流行病学中心对2011年以来收集自全国16个省份的2 915份临床腹泻猪群样品(肠道、粪便等)进行了PEDV、TGEV检测,检出PEDV阳性1 223份、TGEV阳性109份,PEDV、TGEV检出率分别为41.96%、3.74%;对2014年以来收集自14个省份的12 430份临床健康猪组织样品(淋巴结、扁桃体等)进行了PEDV检测,检出阳性325份,检出率为2.61%。针对引发新型冠状病毒肺炎的病原2019新型冠状病毒(2019-nCoV),对2018—2019年收集自15个省份的2 658份生猪组织样品开展了追溯性检测,结果均为阴性。对2019-nCoV与猪源冠状病毒的亲缘关系进行了分析。基于全基因组的遗传进化分析表明:2019-nCoV与同为β冠状病毒属的PHEV核苷酸同源性仅为54%,与α、δ属猪源冠状病毒亲缘关系更远。基于以上数据与分析,可初步排除2019-nCoV来源于已知猪源冠状病毒的可能性。     

猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用

猪δ冠状病毒(PDCo V)是2014年在美国最新检测出的一种猪源冠状病毒。为评估PDCo V在我国的感染和流行情况,根据Gen Bank中登陆的PDCo V M基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,建立了一种基于M基因的猪δ冠状病毒RT-PCR检测方法。研究结果表明,该方法特异性较好,仅对PDCo V有特异性的扩增,对其它主要猪病病毒核酸扩增均呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.33×104拷贝/μL。运用该方法对我国华东地区猪场2014~2015年间的492份临床样品进行检测结果显示,PDCo V总阳性率为2.85%(14/492),其中腹泻样品中阳性率为18.60%(8/43),表明本研究建立的RT-PCR方法可以对临床样品进行有效检测。     

仔猪先天性震颤瘟病毒RT-PCR检测方法的建立

旨在建立检测仔猪先天性震颤瘟病毒(APPV)的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法。根据GenBank上登录的APPV基因组序列,设计1对引物,以临床上表现典型震颤仔猪的淋巴结为材料,提取RNA,建立了RT-PCR方法,并进行敏感性、重复性和特异性试验,对其扩增产物测序比对分析;利用该方法,对临床病料进行检测。结果显示,从典型震颤仔猪的淋巴结中均扩增到与预期大小有一致的片段,经测序比对,扩增片段序列与APPV相应片段的核苷酸同源性在89%以上;该方法只能扩增出APPV片段,而其他几种常见猪病毒均为阴性,3次重复检测结果基本一致,可检测最低cDNA浓度为184.11ng/μL;对临床病料检测,典型病例的检出率达100%。试验结果表明,建立的RT-PCR方法具有良好的特异性、重复性、敏感性等优点,可用于临床APPV引起的仔猪先天性震颤早期检测、病毒鉴定和分子流行病学调查。     

泥鳅营养需求研究进展

泥鳅是适应性较强的杂食性鱼类,主要养殖品种有大鳞副泥鳅(又称黄斑鳅)和真泥鳅(又称泥鳅),肉质鲜美,营养价值高,销售量大,深受消费者喜爱。泥鳅营养需求是配制饲料的理论基础,但目前研究报道较少。为此,本文介绍了泥鳅基本营养需求研究概况,对泥鳅营养需求研究提出了一些看法,以期为建立和完善泥鳅的营养标准和高效配合饲料的开发提供科学参考。     

饲粮能量水平对育肥前期锦江牛瘤胃发酵及血液生化指标的影响

本试验旨在探讨饲粮能量水平对育肥前期锦江牛瘤胃发酵及血液生化指标的影响。试验选用50头初始体重为(301.7±30.1) kg的锦江去势公牛,随机分成5个组,即A、B、C、D和E组,每组10头牛。A组饲喂基础饲粮,B、C、D、E组饲粮综合净能在A组基础上依次提高6%、12%、18%、24%,5组饲粮综合净能水平分别为6.02、6.38、6.74、7.10、7.46 M J/kg,粗蛋白质水平一致。预试期10 d,正试期116 d。结果表明:1)随着饲粮能量水平的提高,瘤胃液pH呈逐渐降低的趋势;瘤胃液乙酸含量逐渐升高,丙酸含量逐渐下降,其中C、D、E组乙酸/丙酸显著低于A组(P<0.05),总挥发性脂肪酸(TVFA)含量呈现上升趋势; C组瘤胃液氨态氮(NH3-N)含量显著低于A组(P<0.05),而菌体蛋白(MCP)含量显著高于A组(P<0.05)。2)随着饲粮能量水平的提高,血清葡萄糖(GLU)含量呈逐渐上升的趋势; C和E组血清尿素氮(UN)含量较A组显著降低(P<0.05),高密度脂蛋白(HDL)含量较A组显著升高(P<0.05)。3)随着饲粮能量水平的提高,E组血浆生长激素含量显著高于A、B、C组(P<0.05); E组血浆胰岛素含量显著高于A组(P<0.05);血浆三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)及胰岛素样生长因子-1含量各组间均无显著性差异(P>0.05)。综上所述,适宜的饲粮能量水平具有改善瘤胃内环境的作用,在育肥前期,随着饲粮能量水平的提高,各组锦江牛的机体代谢处于正常状态,血清GLU含量随之增加,更有利于其发挥生产潜力。在本次试验条件下,结合各项指标得出:育肥前期锦江牛饲粮的综合净能水平为6.74 MJ/kg时效果最佳。     

兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定及体外抑菌试验

为鉴定外伤感染死亡兔的病原菌,采集病死兔肝、肺、肾等器官进行细菌分离鉴定及体外抑菌试验。结果表明:分离菌靛基质、枸橼酸盐等试验为阴性,凝固酶和过氧化氢酶试验为阳性,分解葡萄糖、麦芽糖等,不能分解淀粉;病菌对青霉素、卡那霉素等高度敏感,对氨卡西林,阿莫西林等耐药;枯草芽孢杆菌和鸡唾液乳酸杆菌对其均有较强的抑制作用。因此,分离菌为免金黄色葡萄球菌,该病是由金黄色葡萄球菌引起的兔葡萄球菌病,防治首选药物为青霉素,枯草芽孢杆菌和鸡唾液乳酸杆菌可减少或部分取代抗生素对该病的防治。     

奶牛乳房炎对主要牛奶成分的影响

通过选择年龄、胎次、产奶量、泌乳期等指标相近的健康奶牛4头,临床型乳房炎自然发病病例4头,连续7d分别抽取4头乳房炎患牛正常乳区、患病乳区及4头健康奶牛的牛奶进行测定,测定乳房炎病牛治疗过程中的乳蛋白、乳脂、密度、非脂乳固体、乳干物质、乳糖等成分含量,并对这些测定数据进行相关性差异分析。结果显示,同一头患牛的患病乳区的各乳成分含量极显著高于正常乳区;乳房炎患牛正常乳区组、异常乳区组与健康奶牛组的乳成分含量均存在显著性差异(P<0.05)或极显著差异(P<0.01),健康奶牛的乳脂含量极显著高于乳房炎患牛正常和异常乳区组;乳房炎患牛的正常、异常乳区组与健康奶牛组的牛奶成分含量均值图存在明显变化趋势,健康牛组的牛奶成分在一周内保持稳定,而乳房炎患牛的正常与异常乳区在一周内都存在曲折上升和不断上升的过程。乳房炎患牛正常乳区各成分含量显著低于异常乳区。乳房炎患牛的乳蛋白、非脂乳固体、乳糖含量高于健康牛,乳脂低于健康牛,乳干物质则与健康牛保持相对平衡。     

柠檬酸稀土对锦江黄牛屠宰性能、肉品质及脂肪代谢的影响

本试验旨在研究柠檬酸稀土对锦江黄牛屠宰性能、肉品质及脂肪代谢的影响。选用年龄、体质量相近的健康育肥期锦江公牛为试验动物,共12头,平均体质量为(374.75±4.02)kg,随机分成2组,即对照组和试验组,在试验组饲粮中的添加柠檬酸稀土400 mg/kg,对照组不添加柠檬酸稀土。试验期为期70 d。饲养试验结束进行屠宰,测定其屠宰性能,分析测定肉品质指标和脂肪代谢相关酶及激素指标。结果显示:饲粮中添加柠檬酸稀土显著提高了平均日增质量(P<0.05),显著降低了料质量比(P<0.05);饲粮中添加柠檬酸稀土可显著提高血清中GH和瘦素的水平(P<0.05);饲粮中添加柠檬酸稀土显著降低了育肥期锦江黄牛的脏脂率和脂肪率(P<0.05),有降低背膘厚及板油率的趋势(0.05≤P≤0.1);饲粮中添加柠檬酸稀土显著提高了牛肉中粗蛋白的含量(P<0.05),降低了粗脂肪及干物质的含量(P<0.05),同时具有提高剪切力的趋势(0.05≤P≤0.1);饲粮中添加柠檬酸稀土显著降低了肝脏中MDA的活性(P<0.05),对FAS活性具有降低的趋势(0.05≤P≤0.1);饲粮中添加柠檬酸稀土显著提高了肝脏中LPL的活性(P<0.05),对TL也有升高的趋势(0.05≤P≤0.1)。结果表明,饲粮中添加400 mg/kg的柠檬酸稀土可改善锦江黄牛生产性能和屠宰性能,提高肌肉中粗蛋白含量,同时还有明显的降低育肥期锦江黄牛体内脂肪含量的作用,提高肉牛养殖效益。     

不同比例苎麻和象草混合青贮饲料品质比较研究

本试验旨在比较不同比例苎麻和象草混合青贮饲料品质,为调制高品质的苎麻青贮饲料提供理论依据。以苎麻和象草为原料,按苎麻和象草干物质比例为2∶8、3∶7、4∶6和10∶0(A、B、C、D组)进行混合青贮,青贮45d后测定混合青贮饲料的营养成分、青贮发酵品质及瘤胃降解特性。结果表明:1)单独青贮苎麻的丁酸含量高,弗氏评分等级仅为“劣”,添加象草进行混合青贮可显著提高苎麻青贮饲料的品质;混合青贮饲料的营养价值随象草比例增加而显著提高,其青贮发酵品质在混合青贮比例高于70%时显著降低(P<0.05);苎麻和象草以2∶8的比例混合青贮时其青贮饲料品质最佳,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF))含量和氨态氮/总氮较低,而粗蛋白质和乳酸含量较高。2)A、B、C组混合青贮饲料在6~72h的干物质、有机物、粗蛋白质、NDF和ADF等营养物质在瘤胃中的降解率随其在瘤胃停留时间的延长而逐渐增加;对于干物质、有机物、ADF而言,A组降解率最高,C组次之,B组最低。对于粗蛋白质、NDF而言,3组之间差异不显著(P>0.05),但A组混合青贮饲料的粗蛋白质、NDF有效降解率最高。综合分析,建议在生产中苎麻和象草混合青贮的最适比例为2∶8。     

规模化猪场污水处理效果分析——以乐平市金园牧业有限责任公司猪场为例

为探究规模化猪场污水的处理效果,本试验以乐平市金园牧业有限责任公司猪场为试验对象,分别在猪场污水处理的不同阶段(固液分离池、沼气池和氧化池)的出水口处采集污水样,测定在不同处理阶段污水中污染物和金属元素的含量,与国家规定排放标准进行比较,分析处理效果,并提出改进措施。结果显示:污水经过固液分离、厌氧发酵、曝氧氧化等处理后,污染物中的SS、TP和BOD5达到了排放标准,但NH^+3-N和COD含量超标;金属元素中Cu、Mn、Zn和Cr^6+达到了排放标准,但Cd含量超标。以上结果可知,该猪场当前的污水处理体系虽然在一定程度上可行,但仍有部分指标未达到国家规定的排放标准,需从营养源头减量化排放、污水处理工艺设计减量化排放和沼液的后续处理等方面进行改进和优化。     

犬基因组结构和多态性研究进展

家犬是最早被驯化的家养动物,通过选择进化和培育,世界上注册的已有超过400多个犬品种,每个品种都具有独特的生理、行为和形态特征。利用高密度芯片技术进行犬全基因组多态性分析,并通过基因组多态信息扫描定位功能基因成为热点,总结和综述了犬基因组结构变异和多态信息的研究进展,为开展家犬基因组学研究提供新的方法和思路。     

牧草细胞壁降解菌的群落结构多样性研究

本试验通过高通量测序法研究了吸附在牧草细胞壁降解菌的群落结构,分别将粉碎后的苜蓿、燕麦草、羊草和稻草茎秆3.0g放入尼龙袋中,降解24h全部取出,洗净后提取总DNA,根据高通量测序要求制样。结果表明:(1)吸附于不同牧草细胞壁中的细菌群落结构丰富度:燕麦草>苜蓿>稻草>羊草;(2)四组牧草样品共鉴定得到16个门,27个纲,37个目,63个科和91个属。门水平上,硬壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门、纤维杆菌门和变形菌门为优势菌门。综上,不同牧草吸附的细菌种类和数量存在显著差异。