猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体，并对mRNA进行转录水平的检测，为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后，用PCR扩增的1．2kb目的片段与pMDl8-T载体连接，将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接，对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录，对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果，所得到的序列与所设计的序列完全一致，表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选；目的片段定向插入，阅读框架正确；RT-PCR成功地反转录得到约1．2kb的目的DNA片段，Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影，见到清晰的1．2kb特异带。     

猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中的表达

将猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达质粒,采用脂质体法转染COS-7细胞,经RT-PCR检测,转染重组质粒的COS-7细胞MSTN mRNA呈阳性,表明该重组体能够在真核细胞中完成转录过程。SDS-PAGE电泳结果有43 ku目的蛋白表达带,并用Western blotting证实了其表达的特异性,表明猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列可以在真核细胞中表达。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体.     

猪肌肉生长抑制素基因的研究进展

肌肉生长抑制素(MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子。其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，表现为双肌征状。最早在小鼠中发现该基因，随后通过荧光原位杂交法将猪MSTN基因定位于15q2.3上，进而分析了MSTN以及其分子结构，比较。MSTN基因在不同物种间的同源性。     

猪肌生成抑制素（MSTN）cDNA的克隆

从猪的肌生成抑制素（MSTN）编码序列中设计引物，以军牧一号猪肌细胞总PNA为模板，利用RT－PCR和嵌套PCR技术，扩增出MSTN cDNA片段。该片段全长1277bp，包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道的一致。经EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶解分析，cDNA片段与pMD18-T载本之间既有正向插入的克隆，也有反向插入的克隆，所得到的MSTN cDNA可用于原核和真核表达载体的构建。     

猪各组织器官内肌生成抑制素基因mRNA表达谱的研究

用Trizol试剂法提取军牧一号猪的骨骼肌、心肌、肝、肾、肺、脾、胰、脂肪的总RNA做RT-PCR和嵌套PCR,结果在军牧一号猪骨骼肌、心肌和脂肪组织内检测到了肌生成抑制素mRNA的表达,而在其他组织中未检测到.     

肌生成抑制素基因研究进展

肌生成抑制素是 1 997年发现的骨骼肌生长发育负调控因子 ,肌生成抑制素不仅在骨骼肌中表达 ,还可在心肌和浦肯野纤维等多种组织中表达。研究表明 ,大鼠骨骼肌在体内的再生 ,对 MSTN m RNA的表达表现出明显的时间依赖性 ,并且 m RNA的表达不必由功能性神经支配。通过对不同品种双肌表型牛 MSTN基因的研究 ,发现其骨胳肌增大的共同特点是肌生成抑制素基因发生了突变 ,如布鲁牛 MSTN基因在编码区外显子 3发生 1 1 bp的缺失 ,导致MSTN此位点后的阅读框架改变 ,并在此点后的 1 4个密码子处终止了阅读框架 ,从而使MSTN被截短 ,MSTN蛋白活性区域消失 ,活性丧失 ,结果肌肉大量增加。目前 ,已分别对人、牛和猪的 MSTN基因进行了定位研究 ,猪肌生成抑制素基因定位研究表明 ,猪 MSTN基因位于1 5号染色体上。     

动物肌生成抑制素基因的研究进展

肌生成抑制素(MSTN)基因是一种生长分化因子,表达产物主要调控骨骼肌生长发育。笔者介绍了该基因的特点、表达调控机理及其研究进展,并提出今后动物MSTN基因重要研究方向及意义。     

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因cDNA序列，分别从第1、第2和第3外显子中设计引物，以大约克猪染色体DNA为模板，分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到pGEM-easyT载体中，然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素因序列，共获得6kb连续序列。分析结果表明，猪肌生成抑制素基因第1内含子长1809bp，第2外显子长374bp，第2内含子长1978bp。所测得的外显子序列与已发表的cDNA序列同源分析比较，没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪（大约克猪）肌生成抑制素基因仍很完整，可通过改变基因结构等降低肌生成抑制素活性的方法提高瘦肉率。     

猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2、R1),采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20 bp序列交叉重叠.F1长38 bp,R1长36 bp,其他片段均40bp长,F1和R1片段两端分别加上限制性内切酶Nco I和Xho I的识别位点序列.经PCR扩增出254 bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致,表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体.从阳性细菌中提取质粒,经Nc0 I和Xho I酶切,回收254 bp目的片段,定向克隆到pET28a中,转化DH5.受体菌,提取质粒,再转化到BL21(DE3)中,成功筛选出阳性克隆.阳性菌经IPTG诱导,通过SDS PAGE,检测出猪肌生成抑制素的表达.     

猪BPI蛋白重组载体的构建及真核表达

试验旨在构建猪BPI真核表达载体,获得猪源BPI重组蛋白.根据GenScript's CloneEZ^® PCR Cloning Kit试剂盒,将BPI编码序列克隆至pUC57载体上,酶切与测序鉴定无误后,将重组质粒pUC57-BPI转染293-6E细胞,并利用SDS-PAGE和Western blotting方法检测其表达水平.结果显示,本试验成功构建了猪源BPI蛋白真核表达载体pUC57-BPI,并在293-6E细胞培养上清中检测到猪源BPI重组蛋白的表达.该猪源BPI重组蛋白体外表达系统的建立为今后深入研究猪BPI的生物学功能以及猪抗菌蛋白的制备提供了试验基础.     

绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达

Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138 bp的转录产物,并用Western blotting检测到78 ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。     

猪MSTN前肽定点诱变载体在C2C12细胞中的表达

本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料.     

崂山奶山羊Myostatin基因真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的表达研究

试验克隆了崂山奶山羊Myostatin基因序列,构建了其真核表达载体,并验证了其在成纤维细胞中的表达。本研究通过从崂山奶山羊肌肉组织中提取RNA,反转录后采用巢式PCR方法扩增出Myostatin基因序列,构建真核表达载体,通过转染成纤维细胞,采用RT-PCR方法验证其表达。结果表明,克隆出崂山奶山羊Myostatin基因的全长cDNA序列,大小为1128 bp,GenBank登录号:GU377303.1;构建pcDNA-MSTN真核表达载体,转染成纤维细胞48 h后通过RT-PCR检测,结果显示,Myostatin表达量显著增加,表明成功构建pcDNA-MSTN真核表达载体,为进一步研究Myostatin的生物学功能及转基因羊培育奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建与鉴定

(目的)构建猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)E基因真核表达载体pCI-E,为探讨E基因的功能奠定基础。(方法)根据GenBank上已发表的PEDV CV777株序列,利用Primer5.0设计1对两端含限制性核酸内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的特异引物,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出完整的231bp的目的基因,将目的基因与pMD19-T载体连接转化到大肠杆菌DH5α中,用测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆体。然后将纯化后的E基因插入表达载体(pCI-neo)上,并经双酶切、测序鉴定。(结果)成功构建了PEDV的pCI-E重组真核表达载体。(结论)pCI-E重组真核表达载体的构建为进一步探讨PEDV E基因的功能和分子生物学特性及PED防御新途径提供依据。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

抗菌肽Shiva1a基因真核表达载体的构建及序列分析

为了探讨天蚕类抗菌肽在动物早期抗感染过程中的作用机理,本研究以Shiva 1a基因的成熟肽为模板设计4条引物,利用重叠延伸PCR技术获得目的基因,并在C端添加6×His的标签。将此序列与真核表达载体pIRES₂-EGFP进行重组,构建pIRES₂-EGFP-Shiva 1a重组表达质粒,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染将重组质粒转染到CHO-K1细胞,荧光显微镜观察其表达情况。通过生物信息学软件对抗菌肽Shiva 1a的二级结构和三级结构进行预测分析。其结果为进一步研究Shiva 1a的抗菌活性和在动物抗病育种方面的应用奠定了基础。     

猪Ghrelin真核表达质粒的制备及对小鼠生长的影响

通过RT-PCR获得猪 Ghrelin基因的cDNA片段,克隆入pcDNA3.1(+)质粒中构建真核表达质粒,将质粒注射到断奶的昆明小鼠的后腿肌肉中,研究Ghrelin真核表达质粒对小鼠生长的影响。结果表明,试验组小鼠在试验第10、20、35 d的增重高于对照组,而在试验结束的第46 d增重无显著差异。说明Ghrelin基因真核表达质粒有促进小鼠生长的作用。