小麦 TaCSL1基因的克隆及表达模式分析

Clavaminate Synthase-Like（CSL）是生物体内的一种氧化还原酶,可催化氨基酸羟基化。为初步了解小麦CSL基因并探究其相关生物学功能,利用同源克隆的方法,以拟南芥 At3g21360（GenBank Accession：NC_003074.8）基因CDS序列为探针搜索小麦基因组核酸序列数据库,得到小麦A、B、D三个亚基因组上的部分同源基因序列。对上述三条序列的全长与编码区进行克隆和测序,经生物信息学分析,发现这三个基因编码的蛋白属于CSL家族。命名该基因为 TaCSL1,来自A、B、D三个亚基因组的部分同源基因分别命名为 TaCSL1-3A、 TaCSL1-3B、 TaCSL1-3D。实时荧光定量PCR分析表明,这三个部分同源基因在小麦不同生长发育阶段和不同组织部位均有表达,除叶鞘组织外,其相对表达水平在各时期叶片中均高于其他组织。分析该基因在小麦不同生长发育时期叶片的相对表达水平发现,该基因的相对表达量在幼苗期至孕穗期持续提高,抽穗期显著下降,开花后再次提高,生育末期降低。就三个部分同源基因的表达水平而言, TaCSL1-3A相对表达量均较低,而 TaCSL1-3B的相对表达量在孕穗期之前最高, TaCSL1-3D在孕穗期之后最高。本研究明确了 TaCSL1的时空表达特征,可为深入研究小麦氨基酸羟基化过程和植物抗病机理研究提供新思路。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

大麦气孔发育相关基因HvSPCH的克隆及初步功能分析

气孔是植物与外界进行气体交换的通道,对植物的生长发育至关重要。SPCH转录因子与气孔的发育关系密切,为揭示其在大麦中的功能,以大麦G1614为材料,利用PCR方法克隆大麦SPCH（HvSPCH）基因后,进行生物信息学分析,并对该基因在干旱胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,HvSPCH基因编码区长为1 098 bp,可编码365个氨基酸,相对分子量为90 504.73 Da,理论等电点为4.96,为疏水的、不稳定的碱性蛋白质。氨基酸序列分析表明,HvSPCH蛋白的氨基酸序列不含有跨膜结构域和信号肽,含有40个磷酸化位点和27个糖基化位点。二级结构分析表明,HvSPCH蛋白包含35.62%的α-螺旋、8.77%的延长链、2.47%的β-转角和53.13%的无规则卷曲。系统进化分析表明,大麦HvSPCH蛋白与水稻、野生二粒小麦、二穗短柄草的SPCH蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR分析结果表明,干旱处理4 h和12 h时,HvSPCH基因的相对表达量显著升高,说明其有可能参与大麦的干旱逆境响应过程。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

小麦冷休克蛋白基因TaCSP的克隆及表达分析

为深入研究小麦冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)基因,根据大肠杆菌(E.coli)CSPs蛋白保守氨基酸序列,借助生物信息学技术检索小麦EST序列,采用同源序列法拼接了小麦3个冷休克蛋白基因,并以小麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR对其进行扩增;同时,采用荧光定量PCR对3个基因的组织表达特性以及ABA、低温、高温、干旱和盐胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果表明,小麦3个冷休克蛋白基因TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3全长分别为290、374和377bp,各编码69、69、80个氨基酸残基。序列分析表明,TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3之间氨基酸相似性为72.9%~84.3%,与大肠杆菌来源CSPs的相似性为40.0%~79.7%。荧光定量PCR表达谱分析显示,TaCSPs在抽穗期小麦的根、茎、叶和幼穗中均能表达。胁迫分析表明,3个冷休克蛋白基因在小麦幼根中的表达,在低温和ABA处理下,表现为早期诱导、后期抑制,在高温、干旱和盐胁迫下,则表现为早期抑制、后期有所恢复。克隆获得的小麦3个冷休克蛋白基因在根组织中强烈表达,并受ABA和冷胁迫诱导,推测其在小麦抵御逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

BES1(油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制剂1)是一类植物特有的转录因子家族, TaBEH3基因是小麦 BES1基因家族成员之一,为进一步了解该基因的功能,以中国春为材料,克隆了 TaBEH3基因,将其3个同源基因分别命名为 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D。序列分析显示,3个同源基因均包含2个外显子,分别编码356、354和358个氨基酸,启动子区含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件,其中,分生组织表达元件（CAT-box）和脱落酸响应元件（ABRE）在3个基因中普遍存在。系统进化树分析显示, TaBEH3基因在麦类作物中具有更近的亲缘关系。基于qRT-PCR进行的时空表达分析显示, TaBEH3基因在不同组织和不同器官间均有组成性表达,表明 TaBEH3基因在植物生长发育（特别是花器官的发育和形成）过程中具有重要的作用。 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因响应ABA激素胁迫处理,且3个基因的表达量变化趋势一致。     

番茄SlAGO7基因的克隆及表达分析

根据番茄基因组数据库中AG07的EST序列信息,利用RACE和PCR技术从番茄花cDNA和叶基因组DNA中分别克隆S/A G07的cDNA全长序列和基因组序列,用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用Real-time PCR分析S/AG07在整个生长与发育过程中的时空表达模式.结果表明,SlAG07的cNDA全长片段为3 238 bp(GenBank登录号:JX467714),含有3 003 bp的完整开放阅读框,编码1 000个氨基酸,共包含3个外显子和2个内含子.所编码的氨基酸序列含有两个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与已报道的AGO7蛋白序列有较高的同源性;SlAG07基因属于AGO蛋白家族中ZIPPY/AG07亚族.SlAG07在营养组织叶中微弱表达,主要集中在根和茎表达;而在生殖器官花中强烈表达,表达丰度从花蕾到盛开的花呈递增趋势,但在果实不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表达.由此推测,SlAG07蛋白可能与番茄花器官的发育相关.这为进一步研究该基因通过ta-siRNA干扰途径来调控番茄花器官发育形成的分子机制奠定了基础.     

橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1（GenBank登录号：KC333454）。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。     

青稞4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的克隆及表达分析

为了进一步了解4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase;4CL)基因在黄酮合成中的作用,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了青稞4CL基因(Hv4CL)的cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,对该基因在青稞4个胚乳发育时间段茎、叶和花中的表达情况进行研究。结果表明,Hv4CL基因cDNA序列全长2 107bp,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF,1 662bp),编码553个氨基酸。Hv4CL与小麦同源性最高(96%),且该蛋白序列中包含2个保守的box,即AMP结合盒:boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。qRT-PCR分析结果表明:4CL基因在青稞不同发育时期、不同组织的表达丰度不同,在茎中表达量最高,其次是叶和籽粒。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

青稞法尼基转移酶β亚基编码基因HbERA1的克隆及表达分析

ERA1(Enhanced response to ABA)基因编码法尼基转移酶(Farnesyl transferase)β亚基,该酶在干旱胁迫下对ABA信号负向调控因子的修饰起着关键作用。本研究以青稞(Hordeum vulgare subsp.vulgare)抗旱品种喜马拉雅10号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了ERA1基因全长cDNA序列,命名为HbERA1(登录号:KJ699392)。生物信息学分析表明,该基因全长1 401bp,可编码466个氨基酸序列,蛋白分子量为51.14kD,等电点为5.00。Prosite Scan分析结果表明,HbERA1含有多个干旱胁迫响应蛋白的作用位点,如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点。利用实时定量PCR方法研究了HbERA1在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况,发现在水分过剩处理下(土壤绝对含水量15.5%),HbERA1在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高,并随着土壤绝对含水量的下降而下调表达;进行干旱胁迫后(15.5%)基因表达量也明显下调表达;复水后表达逐渐恢复,复水8h时超过正常表达水平,表明HbERA1基因可能参与调控水涝和干旱胁迫双重信号传导。     

与甘蔗抗黑穗病性相关的14-3-3基因的克隆和表达分析

为了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用,本研究以课题组前期构建的甘蔗抗黑穗病抑制消减杂交文库中筛选出的1个与14-3-3基因同源的EST序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR方法从甘蔗ROC22品种中分离到1个Sc14-3-3基因(Gen Bank Accession Number:KJ577592),并对其序列信息和基因表达情况进行分析。结果显示,该基因ORF长771 bp,编码256个氨基酸残基;Sc14-3-3是定位于细胞质的亲水蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,有10个Ser、3个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,并在N-端有4个蛋白结合区和1个多核苷酸结合区,对翻译和能量新陈代谢起着重要作用;该蛋白属非ε类群,其N-端和中间区域在不同物种间相对保守,C-端差异相对较大。基因表达模式分析显示,Sc14-3-3基因可能参与甘蔗对生物逆境的细胞免疫响应,其对Me JA介导的信号途径应答较SA和ABA早;黑穗病菌胁迫下,Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品种中的表达模式存在差异,其在抗黑穗病品种YC05-179中上调表达且表达量变化明显,揭示了该基因参与甘蔗对黑穗病的应答反应。以上结果为甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究积累了一定的基础资料,并为今后甘蔗的抗病分子育种提供后备基因资源。     

小麦脱水素基因WDHN1-2的克隆及其表达分析

为进一步明确小麦脱水素基因WDHN1-2在逆境条件下的功能,以伞穗山羊草DHN1基因为探针,通过电子克隆及RT-PCR技术获得WDHN1-2基因后对其序列特征进行分析,同时利用基因表达综合数据库及半定量RT-PCR技术对该基因的表达模式进行解析。结果表明,WDHN1-2基因编码区(CDS)长为548bp,编码的氨基酸具有脱水素保守序列K、Y和S片段,与山羊草脱水素EMT25371亲缘关系最近。WDHN1-2蛋白属于稳定且高度亲水蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;该蛋白在亚细胞中定位的可能性:过氧化物酶体细胞核线粒体基质,可能行使转录调控的功能。表达模式分析发现,WDHN1-2基因在小麦开花后22d的胚乳中表达量最高,在ABA、PEG、NaCl及4℃低温胁迫下表达量均先上升后下降。