莲多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。它是许多果蔬等农产品酶促褐变的主因,也在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。用RT—PCR方法,从中国莲（Nelumbo nucifera）幼叶RNA中成功扩增出ppo的部分序列,经克隆测序,得到长度在978-1057bp的序列共7个,编码326～352个氨基酸。与其他物种PPO进行比较,其核苷酸序列相似性为83％-85％,氨基酸序列相似性为84％99％。莲ppo的成功克隆为抑制莲藕的酶促褐变,提高莲的抗虫抗病性等的研究打下了良好的基础。     

无核白葡萄多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

为获得无核白葡萄中多酚氧化酶(PPO)的基因序列,以无核白葡萄果实为试材,进行基因同源克隆,得到多酚氧化酶基因CDS全长序列,其完整的编码框为1 824 bp,编码607个氨基酸(GenBank登陆号为KP271928);系统进化分析可知,其与葡萄科植物PPO基因同源性最高;生物信息学方法发现该蛋白分子量为67 392.44 Da,等电点为6.42,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有一个跨膜结构域,为亲水性蛋白;二级结构预测发现,PPO具有CuA与CuB两个结合区,分别嵌入蛋白活性腔中。该研究为进一步从分子水平探讨多酚氧化酶与褐变的关系奠定理论基础。     

草莓果实多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶。它是诱导许多果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时在植物的生长发育、抗病虫害及果实品质形成等方面也起到了一定的作用。本文用RACE的方法,从草莓幼果cDNA中成功扩增出PPO基因的3′端部分序列。序列分析表明该基因片段编码424个氨基酸。与其他物种PPO核苷酸序列比较相似性为72％-80％,氨基酸相似性为82％～87％。草莓多酚氧化酶基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及果实品质的改良打下了坚实的理论基础。     

粉蕉ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

本研究根据GeneBank公布的ACC氧化酶(ACO)基因的保守序列设计一对引物,通过RT-PCR方法从成熟粉蕉果实(ABBgroup)中克隆到一条新的香蕉ACO基因全序列。该氧化酶cDNA全长1172bp,基因编码区共957bp,推测其编码318个氨基酸。分析发现,该基因除了与登录号为X95599的香蕉ACO基因核苷酸序列一致性为84%外,与其它基因库上公布的香蕉ACO基因核苷酸序列一致性为94%￣98%,而且,这些香蕉ACO基因核苷酸推导出的氨基酸序列总体一致性为95.81%。聚类分析结果表明,相同基因型的果实克隆出的香蕉ACO氨基酸具有更多的同源性。另外,将该香蕉ACO氨基酸与其它12种重要的果实的ACO氨基酸相比较,其序列一致性也很高。其与芒果一致性高达98%,与菠萝、番木瓜、葡萄、苹果,桃、梨、柑、橙等一致性也在68%￣76%之间。同时发现这13种ACO氨基酸有9个较长的保守结构域。系统树分析结果表明,具有相似的生长环境和相似的生理特性的果实ACO基因具有更多的同源性。     

蜜梨果实多酚氧化酶酶学特性的研究

多酚氧化酶（PPO）是酶促褐变的关键酶,与果蔬加工制品的色泽、抗氧化能力密切相关。以蜜梨果实为原料,邻苯二酚为底物,采用分光光度法研究蜜梨多酚氧化酶的酶学特性。结果表明：pH和温度对蜜梨PPO活性有明显的影响,其最适pH为4．5,最适温度为34℃。在加工过程中,可通过调节pH和温度来降低蜜梨PPO活性,减少褐变的发生：蜜梨PPO催化底物邻苯二酚的酶促反应动力学与米氏方程高度符合,R^2-0．9972,其动力学方程为专1/V=0．17371/[S]＋0．4775,最大反应速率Vmax=2．09U·min^-1,米氏常数Km=0．36mol·L^-1;蜜梨PPO具有一定的热稳定性,随着温度的提高。完全抑制PPO活性所需要的时间逐渐减少。采用短时高温（90℃,1min）的热处理,不仅可有效降低蜜梨加工过程中的酶促褐变．而且可减少蜜梨汁营养成分的损失．较好地保持其固有色泽。     

梨FWL5基因克隆及表达分析

Fw2.2是调控果实大小的数量性状基因,在果实生长发育过程中扮演重要角色。为探明梨FWL(fruit weight 2.2-like)家族基因在果实发育过程中的作用,本研究以小果型野生杜梨、中果型库尔勒香梨、大果型库尔勒香梨芽变品种‘早美香’以及大果栽培型鸭梨为试验材料,从梨基因组中筛选分离出梨FWL5基因,对该基因进行克隆和序列分析,并利用荧光定量PCR技术检测梨FWL5基因在四个梨品种的果实细胞分裂期表达水平。结果显示,梨FWL5基因开放读码框长度为729 bp,编码了242个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,存在两个跨膜结构。结构域分析发现梨FWL5蛋白包括一个富含半胱氨酸的结构域,属于PLAC8家族基因。系统进化树分析表明,梨FWL5与樱桃Pav CNR12蛋白序列最相近,樱桃PavCNR12蛋白在细胞分裂期能够负调控甜樱桃果实大小,并有可能参与重金属转运。荧光定量PCR检测结果显示,在花期,梨FWL5除在鸭梨盛花期表达量较高,在其余三个梨品种中表达水平相对一致。在幼果期,除‘早美香’外,梨FWL5基因表达水平为杜梨>香梨>鸭梨。本研究结果可为梨FWL5基因在调控果实大小...     

陕西省地方小麦品种多酚氧化酶基因等位变异检测及分布

小麦籽粒中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因活性与面条等面制品颜色褐变密切相关,降低籽粒PPO活性是小麦品质改良的重要目标.利用PPO基因的功能标记PPO18和PPO29,对115份陕西省地方冬小麦品种(系)进行2A和2D染色体上PPO等位基因印Ppo-A 1a、Ppo-A1b和Ppo-D1b检测,并分析了品种等位变异的分布特点.结果显示:PPO18在等位基因Ppo-A1a(高PPO)和Ppo-A1b(低PPO)中分别扩增685 bp和876 bp的片段,PP029在Ppo-D1b(高PPO)等位基因中扩增490bp的片段.115份品种(系)中Ppo-A1a、Ppo-A1b6和Ppo-D1b等位基因的频率分别为37.39%、60.00%和45.22%.在陕西省所培育和引进的冬小麦品种(系)中,地方当家品种中最低PPO活性基因分布较多,而引进的冬小麦品种中高PPO活性基因分布较多.     

利用同源序列发掘抗病候选基因的方法

抗病基因的分离和克隆对于实施作物抗病基因育种及开展抗病机制的研究具有重要意义。目前植物抗病基因的克隆方法主要有转座子标签技术和图位克隆技术。该法对于未知基因产物或者没有进行精细定位的性状来讲，其应用受到极大限制。近年来，很多研究探索了利用同源序列发掘抗病候选基因的途径。本研究归纳和总结了三条发掘抗病候选基因的方法，旨在对作物抗病基因及其连锁标记的发掘起到一定的指导作用。     

软儿梨冷冻贮藏过程酚类物质与多酚氧化酶的区域化分布

为研究冷冻贮藏中不同部位酚类物质和多酚氧化酶的分布特征,以青海省地方梨优良品种‘软儿梨’果实为研究材料,采用高效液相色谱法和比色法测定软儿梨果实后熟(室温)、冻藏(-18℃)和解冻(室温)3个时期的果皮、果肉中总多酚、绿原酸的含量和多酚氧化酶活性。结果表明:软儿梨果实后熟后,酚类物质果肉?果皮,多酚氧化酶则果皮?果肉;冷冻贮藏过程中,不同部位的酚类物质和多酚氧化酶均呈现不同程度的升高,但绿原酸在果皮急剧下降、果肉中略有增加。解冻后总体呈下降趋势,2个部位总酚、多酚氧化酶下降明显,而果皮中的绿原酸变化不大。研究表明:软儿梨果实后熟后,酚类物质和多酚氧化酶分布呈现区域化,冷冻贮藏加剧了酚类物质和多酚氧化酶活性的积累,导致了软儿梨冷冻贮藏后果皮先于果肉发生了褐变。     

富有柿果ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以富有柿果为材料,用RNA提取试剂盒提取总RNA,根据已报道的柿果ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase,ACO)基因的序列设计并合成1对引物,通过RT-PCR方法获得1条约1.2 kb特异片段,把该片段连接到pGEM-T easy vector上进行测序,其全长共1 237 bp,编码区697 bp,共编码231个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与DK-ACO1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸的同源性达98%。     

葡萄多酚含量和多酚氧化酶（PPO）活性与组培苗生根关系的初步研究

研究测定了葡萄属10个种(品种)组培苗的多酚含量和多酚氧化酶(PolyphenolOxidase,PPO)的活性,对其与组培苗的生根指数进行相关性分析,并建立生根指数与多酚含量、多酚氧化酶的多项式回归方程。结果表明:不同种(品种)间多酚含量和PPO活性有显著性差异;多酚含量和PPO活性相关性显著,PPO活性和生根指数不相关,而多酚含量与生根指数呈显著负相关;从回归方程可以看出,PPO活性对生根指数的作用是非线性的,多酚含量对生根指数的作用是线性的,这说明多酚含量对组培苗生根的直接作用很大,PPO活性通过多酚含量间接影响组培苗生根而且直接作用较小。     

猪伪狂犬病病毒河南分离株gE全基因的克隆与序列分析

为了确定河南部分地区按照正常免疫程序接种猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失苗的猪场是否发生了PRV野毒感染,了解新流行株的主要毒力基因g E是否发生变异,利用PCR方法,对南阳、周口、巩义、济源、漯河、原阳等地采集的疑似PRV感染的病料进行检测。对PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞,传至6代,分离出9株PRV,克隆其g E全基因并进行序列分析。结果表明,9株PRV均能扩增出1 862 bp的g E基因,且彼此之间同源性为99.9%~100%,与其他PRV毒株同源性为97.5%~99.6%。9株分离株处于一大分支上,且均含有2个氨基酸插入,在448位和510位均发生氨基酸置换。结果表明,分离株均为PRV野毒株,且g E基因有不同程度的变化,与河南省伪狂犬病的重新流行有密切联系。     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IB-DVVP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料,以其基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于PUC119质粒上,得到重组PUC119质粒。并对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明,YL株与欧洲超强毒株非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

多酚氧化酶基因NtPPOE差异表达的效应分析

为研究烟草中多酚氧化酶基因的功能,本研究从GenBank中挑选一个烟草多酚氧化酶基因Polyphenol oxidase E(基因登录号:NW_015916967.1),命名为NtPPOE.构建NtPPOE基因的CRISPR载体和超表达载体,分别得到NtPPOE基因抑制/过量表达的转化植株.研究表明,基因敲除植株NtP...     

大青杨纤维素合酶PuCesA 7基因片段的克隆及序列分析

本研究以大青杨叶片总DNA为模板,用已登录的欧洲颤杨PtrCesA7保守序列设计引物,进行TD-PCR扩增并将得到的片段克隆到pMD18-T载体中。测序结果分析表明,片段长2341bp将该基因片段命名为PuCesA7。经BLASTX比对,此片段包含6个编码区,共1248bp,编码416个氨基酸。并与欧洲颤杨的PtrCesA7基因的同源性为98%,证明克隆的片段为纤维素合酶基因。将该片段与GenBank中登录的玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、欧洲颤杨(Populus tremuloides)、新西兰辐射松(Pinups radiata D.Don)同源纤维素合酶基因序列比对并进行进化树分析。结果表明,大青杨纤维素合酶基因片段均与它们的亲缘关系较远。