虹鳟脑型肌酸激酶基因cDNA全长的克隆与序列分析

肌酸激酶(Creatine kinase, CK)能够催化磷酸基团在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸间的可逆性转移, 在细胞能量代谢过程中发挥重要作用.以虹鳟(Oncorhynchus mykiss)为研究材料, 使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟脑型肌酸激酶(CKB)基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ548753). 序列全长1 493 bp,其中5′端非翻译区81 bp, 3′端非翻译区266 bp, 开放性阅读框1 146 bp, 编码381个氨基酸.虹鳟鱼CKB蛋白存在两个重要功能结构域,分别为EF-hand结构域和ATP:guanido 磷酸转移酶结构域.构建的系统进化树证实所克隆的肌酸激酶CK基因属于脑型肌酸激酶基因CKB.虹鳟鱼CKB蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的CKB在进化树上最先聚为一支,这与两者同属鲑科鱼类这一事实是一致的.虹鳟鱼CKB蛋白序列与大西洋鲑的CKB蛋白同源性高达99%,与已报道的哺乳动物的CKB蛋白同源性均在80%以上相符,表明CKB基因在进化过程中是高度保守的,在细胞能量发生与转移过程中发挥着重要作用.     

虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用.     

桑树白藜芦醇合酶基因全长克隆及序列分析

根据已知的其他物种白藜芦醇合酶cDNA保守序列设计引物,用RT－PCR技术从桑葚中扩增获得白藜芦醇合酶基因部分cDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列,并拼接得到完整的1442 bp白藜芦醇合酶基因。经序列分析发现,桑树白藜芦醇合酶基因开放阅读框长1170 bp,编码389个氨基酸,氨基酸序列含有芪合酶家族特征信号区GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;该基因与花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高达82．82％,氨基酸序列的同源性高达87．15％。     

黄鳝性逆转差异表达基因F25cDNA的克隆和分析

首先运用组织学手段对黄鳝性腺发育过程进行观察分析,然后运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了差异表达基因(F25) cDNA,并利用半定量RT-PCR分析了该基因于各期性腺组织中的表达.结果表明,通过光镜观察到性腺发育的8个阶段:Ⅲ～Ⅵ期卵巢、间期性腺、早期精巢和晚期精巢.基因F25在卵巢发育早期不表达,即在Ⅱ、Ⅲ期卵巢中不表达,在Ⅳ期卵巢开始表达,同时随着卵巢发育成熟、排卵、退化及精巢发育,表达量明显升高,由此推测基因F25可能在性逆转过程中起到一定的作用.基因F25 cDNA全长为1 139 bp,共编码257个氨基酸,在线SignalP分析表明,基因F25肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白,同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因.     

牛FABGL基因cDNA的克隆与序列分析

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,对牛FABGL基因的cDNA进行了克隆与序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛FABGL基因的cDNA序列长994 bp,包括780 bp的开放阅读框、16 bp的5′非翻译区和198 bp的完整3′非翻译区,由260个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与猕猴、人、猪和小鼠FABGL基因的相似性分别为89%,89%,87%和86%。推导的氨基酸序列与猕猴、人、猪和小鼠的相似性分别为89%,87%,89%和86%。以FABGL基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的FABGL基因在人、猕猴、猪、鼠等物种中,与猪的亲缘关系最近。牛的FABGL蛋白的三级结构包含2个跨膜结构—Cu toff模体,分别位于11~16位氨基酸和128~131位氨基酸处。     

猪PDCD5基因的克隆与真核表达

用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

松江鲈β-肌动蛋白基因全长cDNA的克隆和序列分析

[目的]获得松江鲈β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并检测松江鲈β-肌动蛋白在组织中的表达。[方法]以松江鲈肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE的方法扩增β-肌动蛋白基因cDNA片段,用RT-PCR方法检测组织表达。[结果]获得了松江鲈β-肌动蛋白基因cDNA的3个片段,测序后拼接得到1905bp全长cDNA序列,其包含了1128个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性分析发现,松江鲈β-肌动蛋白基因序列与点带石斑鱼、军曹鱼、红鲷鱼等同源性相对较高,与哺乳动物和鸟类同源性相对较低;系统发育分析表明,松江鲈β-肌动蛋白与点带石斑鱼关系最近。RT-PCR分析表明,该基因在检测的肌肉、肝脏、肠和脑4种组织均有表达。[结论]首次得到了β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并证明了松江鲈的β-肌动蛋白基因非常保守。     

鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析

以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。     

虹鳟鱼trapd基因cDNA的克隆与序列特征分析

易位子相关蛋白δ(translocon associated protein delta,TRAPD)是作为内质网膜蛋白参与细胞内信号序列识别、新生肽链的修饰、转运通道的形成等过程.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,采用RT-PCR和RACE法分离和克隆虹鳟鱼trapd基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591154),序列全长949 bp,其中5'端非翻译区(UTR)长109 bp,3'端非翻译区(UTR)长336 bp,开放性阅读框(ORF)长504 bp,编码167个氨基酸,存在1个跨膜区.虹鳟TRAPD蛋白序列与斑马鱼、黑青斑河豚、大西洋鲑、斑点叉尾鲴、热带爪蟾、人和小鼠等脊椎动物的同源性均在80%左右,表明trapd基因在进化过程中是高度保守的.     

道氏虹鳟同工酶的组织分布及表达

运用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,初步研究了道氏虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的7种同工酶(GDH、SOD、LDH、α-AMY、POD、EST、MDH)在5种组织(眼、心脏、肾脏、肝脏、肌肉)中的分布及位点表达。结果表明,道氏虹鳟除α-AMY外的6种同工酶都具有明显的组织特异性。生化遗传研究发现7种同工酶共记录27个基因座位,多态座位百分数P=29.63%,平均有效等位基因数Ne=1.2963,说明道氏虹鳟的群体遗传多样性在鱼类中处于中等水平。     

三倍体雄性虹鳟(Oncorhynchus mykiss)生殖发育研究

以8~35月龄的三倍体雄性虹鳟为试材,同期二倍体为对照,研究了性腺发育和精子发生过程中组织结构、超微结构以及几种生殖激素含量的变化,以了解染色体多倍化对三倍体虹鳟精巢发育和精子发生的影响,探讨多倍体虹鳟的生殖机制。结果表明,三倍体虹鳟精巢能够发育成熟,但较二倍体发育迟缓,成熟精子量少,精子结构正常、大小不一;精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子5个阶段,各级生精细胞结构与二倍体相同,但体积较大,发生过程中有大量坏死细胞存在,精子变态期尤为明显;败育的生殖细胞被支持细胞所吞噬;生殖激素仅呈现一个生殖周期变化,与二倍体变化趋势相同但滞后。三倍体雄性虹鳟的生精细胞能够完成减数分裂,滞育于精子细胞阶段,由于非同源染色体不规则的联会,产生的精子绝大多数因含有多余的染色体片段成为非整倍体而败育,只有少数生精细胞能够正常发育成精子。     

用热休克法诱导虹鳟四倍体最佳参数的研究

采用热休克法抑制受精卵第一次卵裂诱导虹鳟Oncorhynchus mykiss四倍体,对影响热休克处理效果的3个参数:处理温度(26～31 ℃)、处理持续时间(3～16 min)、处理起始时刻(3 h 15 min～6 h 50min)进行了研究.结果表明:在授精后3 h 45 min,于31℃下热休克处理5、6、7 min,或30℃下处理7、10 min,或29℃下处理10 min,或28℃下处理16 min,都能成功地诱导出虹鳟四倍体胚胎,四倍体的诱导率为13%～33%,发眼期相对存活率为19.52%～96.54%.     

日粮中添加谷胱甘肽对虹鳟生长性能和抗氧化性能的影响

为研究日粮中添加谷胱甘肽对虹鳟Oncorhynchus mykiss生长性能和抗氧化性能的影响,选择初始体质量为(718.3±36.3)g的虹鳟,分别投喂添加5种不同水平的谷胱甘肽饲料(谷胱甘肽含量分别为0、100、200、400、600 mg/kg),8周后观测各组虹鳟的生长情况及机体抗氧化状态。结果表明:虹鳟的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、日均摄食量(AFI)随着饲料中谷胱甘肽添加量的增加均呈现先升高后降低的趋势,且在添加量为200 mg/kg时达到最大值,并显著高于其他各组(P0.05),而200 mg/kg组虹鳟的饲料系数(FCR)则显著低于对照组(P0.05),且死亡率最低(4.04%);谷胱甘肽添加组虹鳟血清、肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性均升高,其中200 mg/kg组血清和肝脏中SOD显著升高(P0.05);谷胱甘肽添加组虹鳟血清、肝脏和鳃丝中过氧化氢酶(CAT)活性均高于对照组,且随着谷胱甘肽添加量的增加呈现先升高后降低的趋势,其中200 mg/kg组血清和肝脏中CAT活性显著高于对照组(P0.05);谷胱甘肽添加组虹鳟血清、肝脏和鳃丝中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性均高于对照组,且随着谷胱甘肽添加量的增加呈现先升高后降低的趋势,其中200 mg/kg组血清、肝脏和鳃丝中GSH和GR活性均显著高于对照组(P0.05);谷胱甘肽添加组虹鳟血清、肝脏和鳃丝中丙二醛(MDA)含量均低于对照组,但均无显著性差异(P0.05),其中200 mg/kg组最低。研究表明,在循环水养殖模式下,饲料中添加适量谷胱甘肽能够提高虹鳟的生长性能,降低饲料系数和死亡率,有助于缓解虹鳟养殖过程中的氧化应激,提高抗氧化能力。     

山女鳟和虹鳟的杂交子代与其亲本后代早期生产性能的比较

用虹鳟Oncorhynehus mykiss和山女鳟Oncorhynchus masou masou两种冷水性鱼类进行杂交试验,成功地获得杂交种。其中,杂交组虹鳟（♀）×山女鳟（♂）的受精率、发眼率和孵化率与山女鳟、虹鳟对照组相比没有明显差异（P〉0．05）,但其卵黄囊吸收较差,上浮率较低,平均成活率为30．68％,明显低于山女鳟、虹鳟（P〈0．01）;杂交组山女鳟（♀）×虹鳟（♂）在胚胎发育后期,眼点形成之前发育受阻,其发眼率仅为0．54％,明显低于山女鳟、虹鳟（P〈0．01）,最终成活率仅为0．44％。对杂交子代和亲本后代进行了80d的室内生长对比试验,结果表明：杂交鳟在不同的发育阶段表现出一定程度的杂种优势,体重的杂种优势率为2．22％-18．16％,又长的杂种优势率为1．27％～8．98％;杂交鳟在日增长量上与山女鳟比较接近,略高于虹鳟。     

4个品系虹鳟生产性能的比较

在相同养殖条件下,选取渤海品系、Jalo品系、道氏虹鳟和美国金鳟4个品系的虹鳟Oncorhynchusmykiss(从受精到2龄之间)进行了两年生产性能的比较。结果表明:从开口摄食到2龄,各品系间虹鳟的成活率无显著性差异(P>0.05);而受精率和孵化率差异显著(P<0.01或P<0.05)。从受精率来看,Jalo虹鳟>道氏虹鳟>渤海虹鳟>美国金鳟;从孵化率来看,渤海虹鳟>Jalo虹鳟>道氏虹鳟>美国金鳟。各品系在饲料转化率、热生长系数和生长速度上也呈现显著差异(P<0.05),Jalo品系>道氏虹鳟>渤海虹鳟>美国金鳟。综合分析生产性能各项指标的结果,认为Jalo品系与美国道氏虹鳟较适合作为商业养殖品系。从体重变异系数和平均杂合度两方面来说,4个品系的虹鳟均适合作为选育的基础种群。     

云南大理虹鳟鱼安全指标评估分析

[目的]对云南虹鳟鱼主要产区的虹鳟鱼的安全指标进行测定。[方法]以云南虹鳟鱼主要产区大理剑川的虹鳟鱼为研究对象,采用原子吸收分光光度计、液相色谱串联质谱仪等检测虹鳟鱼中重金属、兽药等成分的含量,并评估其安全指标。[结果]在检测的虹鳟鱼样品中,仅有2号养鱼场样检出无机砷含量超标,其他挥发性盐基氮、重金属及兽药共16项指标均低于国家淡水鱼NYT842-2012标准。[结论]该研究结果为制定云南虹鳟鱼地方标准奠定了基础。     

金鳟伪雄鱼的制备及全雌三倍体的诱导

以4龄金鳟Oncorhynchus mykiss为试验鱼（雄、雌性平均体重分别为1．7、2．2kg）,采用人工诱导雌核发育技术灭活金鳟精子,对受精卵进行热休克处理后正常孵化,获得初孵仔鱼;再用雄性激素诱导全雌二倍体,得到性逆转雄鱼（伪雄鱼）;培育至性成熟后进行人工繁殖,采用热休克法对受精卵进行处理获得全雌三倍体鱼类。结果表明：金鳟全雌二倍体的诱导出现率为80％,金鳟伪雄鱼获取成功率为75％;用不同pH人工精浆激活伪雄鱼精巢精子,高pH（9—10）的人工精浆激活受精卵的效果最好,金鳟三倍体的出现率为75％-80％,其中还有一定比率的嵌合体出现。