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应用Dot-ELISA检测马铃薯卷叶病毒 总被引:3,自引:0,他引:3
以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体,应用间接ELISA法对纯化的马铃薯卷叶病毒(PLRV)、感染PLRV的马铃薯植株的茎、叶、休眠块茎顶端、脐部、块茎打破休眠后萌发的芽,以及饲毒后的桃蚜体内的PLRV分别进行了测定。结果表明检测纯病毒的灵敏度为45.83pg~4.583pg,测定茎、叶、休眠块茎顶端、脐部、芽的稀释度分别可达到1/2048、1/512、1/2048~1/8192、1/512~1/2048和1/2048~1/8192,和常规DAS-ELISA相比,检测的灵敏度提高至少8倍。应用Dot-ELISA至少可检测1/2头带毒蚜虫体内的PLRV。 相似文献
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RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。 相似文献
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沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV)的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列(GenBank登录号:GQ478314)为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行Hha Ⅰ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ (×1000)可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。 相似文献
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【目的】为了实现对新冠病毒一步法检测。【方法】采用RT-LAMP技术,利用具有反转录酶活性的Bst3.0 DNA聚合酶,以新冠病毒N蛋白基因为模板设计LAMP引物,成功建立了以新冠N蛋白基因为靶基因的RT-LAMP检测方法。同时对反应条件中的温度、镁离子浓度、NTP浓度、甜菜碱浓度以及酶浓度进行优化。通过加入钙黄绿素和氯化锰显色剂对反应结果进行判定,用ASFV p54质粒和JEV NS1质粒与稀释后模板做对照。【结果】温度为66℃,镁离子浓度为6mmol/L,甜菜碱浓度为1 mol/L,NTP为1.4 mmol/L,酶浓度为160 U/L为最优反应条件。【结论】证明了Bst3.0 DNA聚合酶对新冠N蛋白基因检测是成功的,该方法具有良好的特异性以及灵敏度。 相似文献
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转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。 相似文献
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小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。 相似文献
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本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列,筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法 (加SYTO-9)和可视化方法 (加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明,优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×103 fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析,表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0 (1~1, 95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择,对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。 相似文献
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María P. Barrios Barón Verónica C. Delfosse Yamila C. Agrofoglio Vanesa Nahirñak Natalia I. Almasia Cecilia Vazquez Rovere Ana J. Distéfano 《Plant pathology》2021,70(2):259-274
The potato leafroll virus (PLRV) P0 protein (P0PL) is a suppressor of RNA silencing. In this study, we showed that P0 protein from an Argentinian isolate of PLRV (P0PL-Ar) has an additional activity not described for other PLRV or P0 proteins from poleroviruses. Besides reporting that P0PL-Ar displays both local and systemic silencing suppressor activity, we demonstrated, for the first time, that P0PL-Ar impedes accumulation of dsRNA-derived siRNAs. We also showed that P0PL-Ar interacts with Solanum tuberosum SKP1 orthologue (StSKP1) and triggers destabilization of ARGONAUTE 1 (AGO1) and that these actions are mediated by the F-box-like domain. A mutant in the GW/WG motif within the P0PL-Ar F-box-like motif lost the suppression activity, the interaction with StSKP1 and abolished AGO1 decay. Interestingly, a mutant in the L76/P77 residues within the P0PL-Ar F-box-like motif, which lost the suppression activity and the interaction with StSKP1, retained the capacity to enable AGO1 decay. Thus, unlike other P0 proteins of previously characterized poleroviruses, P0PL-Ar seems to have a dual activity, according to the findings of this study. This protein would act at both an upstream and a downstream step of the RNA silencing pathway: upstream of Dicer-like enzyme (DCL)-mediated primary siRNA production and downstream at the RNA-induced silencing complex (RISC) complex level. Our results contribute to the understanding of the different ways PLRV P0 proteins function as silencing suppressors. 相似文献
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马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是危害茄科作物的一种重要病毒,为了建立特异性检测PVX的实时荧光定量PCR体系,本研究以PVX-1985分离物中外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列为模板,设计引物构建重组质粒并选择扩增效率高、特异性强的引物成功构建出标准曲线。利用建立的体系,成功检测到以含pCaPVX440侵染性克隆载体的农杆菌C58C1接种后的本氏烟(Nicotiana benthamiana)中PVX病毒RNA的拷贝数。 相似文献