利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.     

锦鲤疱疹病毒双重PCR检测方法的研究

为了快速确诊锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV),本试验建立了KHV双重PCR检测方法。根据锦鲤疱疹病毒的SphⅠ-5基因和胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(thymidine kinase,TK)基因设计特异性引物,优化反应条件,建立了KHV双重PCR检测方法。结果表明,建立的方法简单、灵敏、准确,一个反应体系可同时扩增292 bp和410 bp两个基因片段,可有效用于KHV的检测。     

多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因

根据对已报道的PCR检测方法灵敏性评价,以常用KHV病毒PCR检测的目的基因KHVSphI片段(AY568590)、KHV5/9(AF411803)和KHVTK基因(AJ535112)作为靶基因,设计并选择3对特异性引物建立的多重PCR检测体系用于KHV病毒多基因的检测。本研究建立的多重PCR体系具有较高的特异性,能够特异性扩增出KHVSphI片段290bp、KHV5/9片段484bp和KHVTK基因片段409bp,对锦鲤和鲤鱼的另外一种病毒性病原鲤春毒血症病毒检测结果为阴性。多重KHV病毒PCR体系检测KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段单一模板的检测下限分别为:10fg、100fg和100fg,在相同模板浓度的情况下,KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段同时被检出的检测下限为100fg。对KHV病毒感染组织的检测结果表明,多重KHV病毒PCR检测结果与常规PCR检测结果基本吻合,在多重PCR检测体系中KHVTK基因片段检测的灵敏度高于检验检疫行业标准方法。结果表明,多重KHV病毒PCR检测方法能够快速、准确和灵敏地检测KHV病毒基因。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

牛分支杆菌αg85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b.     

锦鲤疱疹病毒双基因检测方法的研究

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)双基因检测方法,本研究根据KHV聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)的保守序列设计2对引物,建立两基因同时检测的PCR方法.结果表明,利用双基因同时检测KHV,可以同时特异扩增出570 bp和155 bp片段,而与鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼疱疹病毒无扩增反应.而且所建立的双基因检测方法对临床样品的检测结果与单一PCR方法比较符合率为100％.为进一步研究KHV以及诊断方法奠定了基础.     

北京油鸡和矮脚鸡心脏型、脂肪型脂肪酸结合蛋白基因多态性的研究

根据不同物种间同一基因核苷酸序列的保守性及相似性,设计特异性引物,利用聚合酶链式反应技术(PCR),扩增鸡心脏型脂肪酸结合蛋白(H—FABP)基因第二内含子序列;根据已经发表的鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因mRNA序列,设计特异性引物,扩增鸡A-FABP基因第三内含子序列。选用Hha Ⅰ、Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Xmn Ⅰ和Hind Ⅲ8种限制性内切酶对扩增产物分别进行单酶切,发现H—FABP基因第二内含子Hha Ⅰ PCR—RFLP及A-FABP基因第三内含子Hinf Ⅰ PCR—RFLP。     

应用PCR-RFLP分析鉴别广西鸡毒霉形体

针对鸡毒霉形体(MG)16S和23SrRNA基因间的高变区序列设计合成了1对引物，对MG菌株进行了PCR扩增，获得了1条899bp的DNA片段，而其他禽病病原DNA无扩增。扩增产物经用限制性内切酶AfaⅠ和Dra Ⅰ进行酶切片段长度多态性分析，表明各MG菌株酶切图谱间均存在差异。     

一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定

本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHV ORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj.基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近.将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%.表明本研究在国内首次分离到KHV.     

小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×10⁸ Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。     

锦鲤疱疹病毒GY1506株的分离鉴定

对江苏省某养殖场患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定。现场采样发现,发病鱼体表黏液增多,眼球凹陷,背鳍和鳃部溃烂。剖检后见肝脏、肾脏、胆囊肿大,肠充血。取病鱼组织匀浆上清接种CCB细胞,14 d后可观察到细胞变圆、脱落、空泡化等典型的细胞病变。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,鳃和肠均能扩增出预期大小的特异性产物。序列分析显示,扩增序列与KHV-J毒株胸苷激酶(TK)基因核苷酸序列同源性为100%。根据TK基因序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,命名为KHVGY1506株。     

RT-PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1糖蛋白基因 (引物A)和S1糖蛋白基因N_端高变区Ⅰ (引物B)的 2对引物对 3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及 5个地方分离株 (C60 ,D41A ,D41B ,A112 1,A1171)进行RT_PCR扩增。用引物A时 ,有 5个IBV毒株扩增到目的片段 (172 0bp) ;用引物B时 ,所有 8个IBV毒株均得到与预计大小相符的目的产物 (2 2 8bp)。对 172 0bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切 ,结果得出 3个不同的RFLP图谱 ,其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HaeⅢ酶切图谱。Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱 ;对 2 2 8bp的PCR产物进行DdeⅠ、RsaⅠ限制性内切酶消化 ,根据它们的RFLP图谱 ,8个IBV毒株可分为 5个基因型。综合 2对引物的PCR产物的RFLP分析结果 ,8个IBV毒株可分为 7个基因型 ,分型的结果与传统的血清学方法吻合。本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异、灵敏等优点 ,为现场流行毒株的定型(基因型 /血清型 )及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

养殖锦鲤鲤鱼浮肿病的检测与鉴定

北京房山某锦鲤养殖场锦鲤发生大量死亡,患病锦鲤呈烂鳃、肾脏糜烂、身体浮肿;症状类似锦鲤疱疹病毒（koi herpes virus,KHV）感染,但经PCR检测排除了KHV感染。为进一步确定病原,对发病鱼进行了临床症状观察、病毒分离、细菌分离培养、病鱼组织超薄切片电镜观察和PCR扩增等检测。通过病鱼组织超薄切片电镜观察,在肾脏内可见200 nm×400 nm的痘病毒样颗粒。抽提病毒核酸后,用已知的鲤鱼浮肿病毒（carp edema virus,CEV）的保守序列设计2对引物进行PCR扩增,扩增出548和180 bp片段,测序结果和GenBank公布的CEV H504株序列完全一致。根据发病鱼临床症状和实验室检测结果,最终确定该病为CEV引起的鲤鱼浮肿病。这是在中国首次发现的鲤鱼浮肿病。     

猪趋化因子CXCL12及其受体CXCR4真核表达载体的构建

采用RT-PCR的方法从猪脾脏组织中扩增猪CXCL12、CXCR4基因的cDNA,对编码区核苷酸序列分析后,将扩增产物经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后再克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5HisA,构建了pcDNA3.1-CXCL12和pcDNA3.1 -CXCR4重组质粒,经酶切及测序鉴定后,进行核苷酸同源性分析.结果表明RT-PCR分别获得获得长度为386bp、1019bp的阳性产物,酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-CXCL12和pcDNA3.1-CXCR4构建成功,为进一步研究猪CXCL12、CXCR4基因的功能奠定基础.     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

鸽痘病毒TK基因的扩增、克隆及序列分析

根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1 、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大小的目的片段。对PCR产物用限制性内切酶NcoI进行酶切分析,结果酶切产物得到两条条带,大小分别为628 bp和732 bp,与3个已发表的TK基因分析结果一致。分别将6个禽痘病毒TK基因克隆至pGEM-T Easy载体中,重组质粒经PCR和酶切鉴定后,进行测序。结果表明,本试验获得的TK基因长1 360 bp,存在一个NcoI酶切位点,两个XbaI酶切位点。序列分析表明:PPVD和PPVX同VVG和VVJ的TK基因同源性为100％;在TK基因的编码区内PPVY有一个碱基与其它毒株不同;各毒株TK基因的侧翼都存在15 bp的正向重复序列和8 bp的倒转重复序列;PPVD、PPVX和PPVZ虽然来源于同一个毒株,但TK基因存在差异。     

洼地绵羊MHC-DRB1基因PCR-RFLP多态性分析

为了探讨洼地绵羊MHC-DRB1基因的多态性,采用套式PCR扩增82只洼地绵羊的MHC-DRB1基因第2外显子,其296 bp扩增产物经Sac Ⅰ、Hae Ⅲ限制性内切酶酶切后进行RFLP多态性分析.结果表明,洼地绵羊的MHC-DRB1基因外显子2在Sac Ⅰ、Hae Ⅲ的酶切位点存在多态性,测序发现,这些酶切位点分别...     

奶牛溶菌酶基因原核表达载体的构建

为了构建奶牛溶菌酶(lysozyme,LYZ)原核表达载体,试验人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体p ET32T,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定。结果表明:PCR扩增和双酶切产物的分子质量分别为1 000 bp和400 bp,与预期大小一致;扩增产物经测序鉴定,也与目的片段完全一致。说明原核表达载体LYZp ET32T构建成功。     

RT-PCR方法快速诊断猪传染性胃肠炎

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）标准毒株（Purdue-115）的ORF6（N基因）的基因序列，设计俣成了一对引物Li01/Li02用反转录聚俣酶链反应（RT－PCR）技术对发病猪的粪便进行检测。结果得到与预期大小相一致的约1174bp(N基因）的PCR产物，与从参照毒株TGEV TH－98扩增出的片段大小相一致。进一步用限制性内切酶进行分析，发现从发病猪火花名扩增出的N基因与参照毒株TH－98株具有相同的限制性内切酶图谱，从而证实本病例致病病毒为TGEV。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。