桑树MaMYB308基因的克隆及表达分析

为研究桑树MYB转录因子在桑树非生物胁迫及发育中的功能,本研究以桑树品种'桂优62号'为材料,克隆了桑树MYB转录因子MaMYB308的全长cDNA序列,运用生物信息学手段对其氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交验证其自激活性,采用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式.研究结果显示,MaMYB...     

红掌AaMYB1的表达特征及其在烟草中的过表达

R2R3-MYB转录因子在观赏植物花青素着色中具有关键性的调控作用。为了进一步明确红掌AaMYB1调控花青素合成的功能,本研究采用序列分析、表达特征分析以及在烟草中异源过表达等方法,对AaMYB1进行了功能分析。结果表明,AaMYB1与单子叶植物中调控花青素合成的R2R3-MYB同源性较高。在品种‘Tropical’中,AaMYB1主要在红掌佛焰苞中表达,各组织中的表达量与花青素苷积累密切相关,但在不同品种不同颜色佛焰苞中的表达与花青素苷积累无相关性。单独过表达AaMYB1的T1代烟草花冠檐部因大量积累花青素苷而使颜色变深,且烟草中花青素苷合成途径上的关键酶基因NtDFR和NtANS以及烟草内源调控花青素苷合成的R2R3-MYB基因NtAn2的表达量得到大幅度上调。以上结果进一步明确了AaMYB1具有调控花青素苷合成的功能。     

水稻中一个SUSIBA2相似基因的克隆与表达分析

大麦SUSIBA2是一个WRKY转录因子,它能够识别糖响应元件,激活异淀粉酶基因iso1和淀粉分支酶基因sbeIIb的表达,从而影响胚乳中淀粉的合成。我们根据SUSIBA2的序列,从水稻基因组序列中搜索到一个与其相似的WRKY基因（称为SUSIRI）,含6个外显子。采用RT-PCR技术,我们从水稻的幼穗中克隆到该基因的cDNA,全长为1921bp,其中ORF长1755bp,可编码584个氨基酸,并具有典型的双WRKY结构域,与大麦的SUSIBA2相似度达81%。Northernblot分析结果显示,该基因在水稻抽穗至种子成熟的发育过程中,在稻穗中的表达活性是逐渐减弱的。     

大豆MYB基因GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB蛋白是植物体中一类重要的转录因子,广泛参与植物生理代谢和发育过程的调节.本研究对利用RACE-PCR分离克隆的MYB转录因子基因GmMYBJ7的功能进行了初步研究.Norhern杂交对GmMYBJ7在不同组织中的表达情况进行了检测,结果只在茎、叶中检测到了GmMYBJ7的表达;酵母表达结果显示,GmMYBJ7具有...     

小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析

TaPIM1是从小麦中克隆获得的1个病原诱导的小麦MYB基因,编码由323个氨基酸残基组成的蛋白TaPIM1。TaPIM1具有R2R3类MYB转录因子的典型结构,即2个保守的MYBDNA结合域(R2和R3)、核定位位点和酸性激活区。TaPIM1的全长氨基酸序列与已克隆MYB蛋白的一致性仅为43.69%以下,为植物MYB转录因子家族R2R3亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中TaPIM1基因的上调表达,说明TaPIM1可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将TaPIM1基因构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38品系。通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,鉴定出转TaPIM1基因烟草T0代株系M66、M102、M110等12个株系。对转基因烟草T1代株系进行PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析,结果表明,TaPIM1超量表达的转基因烟草株系M66、M102和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照,TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌的防御反应。     

MYB1和MYB10基因在部分苹果属植物中的变异分析

为研究参与花青苷合成调控MYB1和其等位基因MYB10在苹果属中的多态性和进化特征,以苹果属部分植物为材料,通过RT-PCR技术扩增MYB1和MYB10基因序列,测序并预测分析比较其蛋白质结构。试验共得到6种材料的MYB1序列,除美丽海棠和新疆野苹果基因CDS编码区为1 209 bp外,其余均为1 239 bp;获得9种材料的MYB10序列,除西府海棠的基因CDS编码区为717 bp外,其余均为732 bp。MYB1与MYB10蛋白序列比较结果显示,MYB1的多态性显著高于MYB10,序列保守性差异可能与其基因功能分化有关,且MYB1有两处多态性位点是碱性的精氨酸和非极性的亮氨酸的互换,且位点恰好位于功能结构域,可能对苹果属不同植物的MYB1功能产生影响。结果表明MYB1和其等位基因MYB10在苹果属中的多态性存在显著差异,揭示了其在进化中产生的功能分化,可为该基因座基因功能研究和苹果果色的调控机制研究提供进一步的理论基础。     

海岛棉转录因子基因GbMYB60的克隆、表达及其抗逆性分析

MYB转录因子是在真核生物细胞内广泛存在的一类转录因子蛋白,在植物的生长发育、代谢调节、抗病抗逆、以及激素介导的信号路径等方面都发挥着重要的作用。本研究从海岛棉品种海7124中克隆得到一个MYB转录因子基因,根据序列同源性和进化分析,将其命名为GbMYB60。该基因序列长990 bp,编码一个36.9 kD的R2R3类MYB转录因子蛋白。GbMYB60蛋白被特异地定位于植物细胞核。GbMYB60基因的表达水平较低,在真叶中优势表达,根系中表达量最低。该基因受甘露醇、NaCl、低温、高温等非生物逆境,以及脱落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸等植物激素的诱导上调表达。利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中干涉GbMYB60发现,降低GbMYB60基因的表达水平,使棉花幼苗对高盐胁迫的耐受性降低;但GbMYB60干涉的植株在甘露醇溶液的处理下与对照植株并无显著的抗性差异。     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB转录因子以保守的DNA结合域为共同特征, 是植物最大的转录因子家族之一, 广泛参与植物代谢调控。本文根据植物中MYB转录因子的DNA保守结构域, 通过RT-PCR和RACE的方法从大豆品种吉林3号的叶片中分离得到了2个MYB基因GmMYBJ6和GmMYBJ7, 并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组DNA序列分析表明, 两个基因都含有两个内含子; 酵母系统检测表明, 两个基因均具有转录激活活性; β-半乳糖甘酶活性分析表明, 内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低; 实时荧光定量PCR检测结果显示, GmMYBJ6在大豆中的表达受ABA、GA3和NAA的诱导, 而GmMYBJ7的表达则受ABA和NAA的诱导; 半定量RT-PCR分析表明, 两个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6和GmMYBJ7为典型的R2R3-MYB转录因子新基因; 他们在大豆中的表达可能与ABA和NAA的信号转导途径有关。     

大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB转录因子以保守的DNA结合域为共同特征, 是植物最大的转录因子家族之一, 广泛参与植物代谢调控。本文根据植物中MYB转录因子的DNA保守结构域, 通过RT-PCR和RACE的方法从大豆品种吉林3号的叶片中分离得到了2个MYB基因GmMYBJ6和GmMYBJ7, 并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组DNA序列分析表明, 两个基因都含有两个内含子; 酵母系统检测表明, 两个基因均具有转录激活活性; β-半乳糖甘酶活性分析表明, 内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低; 实时荧光定量PCR检测结果显示, GmMYBJ6在大豆中的表达受ABA、GA3和NAA的诱导, 而GmMYBJ7的表达则受ABA和NAA的诱导; 半定量RT-PCR分析表明, 两个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6和GmMYBJ7为典型的R2R3-MYB转录因子新基因; 他们在大豆中的表达可能与ABA和NAA的信号转导途径有关。     

酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析

提取酿酒酵母DNA，PCR法合成片段长度为1902bp的NHX1基因，构建植物高效表达载体转化烟草，经PCR扩增、GUS酶染色分子鉴定后，应用荧光定量PCR分析转化材料幼根NHX1基因的转录水平，并将各转化材料T1代烟苗移栽至中间试验隔离圃中，化验分析烟叶内在成分。获得抗卡那霉素、NHX1基因PCR扩增和GUS染色阳性的转化子42株，在转化材料幼根中可检测到外源基因NHX1转录的mRNA分子；烟叶内在成分化验结果表明T1代转化材料烟叶含钾量增加30％，总糖含量显著降低，证明NHX1基因除了与Na^＋运输有关还与K^＋的吸收和糖分运输有关。     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

玉米蛋白激酶基因ZmPti1-1的cDNA克隆及其表达特性

应用电子克隆的方法获得了玉米的一个Pti1（Pto-interacting 1）同源基因的全长cDNA,命名为ZmPti1-1（GenBank接受号为EF158035）。推断ZmPti1-1蛋白含有362个氨基酸,分子量为39．00kDa,p1为8．14,包含蛋白激酶催化结构域保守的11个亚结构域。在水杨酸（Salicylic acid,SA）、甘露醇、氯化钠、脱落酸（Abscisic acid,ABA）和4℃低温的诱导下,ZmPti1-1在玉米幼苗叶片中的表达量明显上调。同时,在玉米不同发育时期、不同组织器官内,ZmPti1-1的表达水平也有很大差异,在子房中表达量最高,在雄蕊中检测不到表达。试验结果表明,ZmPti1-1是一个玉米类Pti1基因,响应生物胁迫和非生物胁迫的诱导。     

黑果枸杞LrDREB1基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

DREB(Dehydrate responsive element binding factor)转录因子是植物非生物逆境适应中的关键调节因子,该类转录因子具有保守的AP2/EREBP结构域,在低温、高盐等非生物逆境胁迫下,可调控下游逆境应答基因的表达,对增强植物的抗逆能力有重要作用。黑果枸杞具有极强的耐干旱、盐碱能力,为研究黑果枸杞DREB类基因在低温、盐碱响应中的功能,本研究以强抗盐灌木黑果枸杞总RNA为模板,基于前期转录组测序拼接序列,利用RT-PCR方法克隆得到一条DREB基因。该基因含有一个1116 bp的开放阅读框,编码372个氨基酸。系统进化树分析显示,Lr DREB1基因属于DREB亚家族A2组成员,与拟南芥AtDREB2B、AtDREB2E具有较高的相似性。荧光定量PCR结果显示,Lr DREB1受盐胁迫、ABA胁迫和低温胁迫诱导表达,可能参与依赖ABA的信号转导途径,调节黑果枸杞抗盐响应。本研究通过对黑果枸杞LrDREB1基因的克隆、序列分析和表达分析,为研究Lr DREB1的功能及黑果枸杞抗盐机理提供了帮助。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

三白草APETALA1基因的克隆和在苞叶中的表达

三白草属于三白草科,其花没有花萼和花瓣,开花时顶端三片苞片变白。A-class MADS-box基因在花发育过程中起着重要作用。APETALA1(AP1)基因属于花分生组织识别基因,调控花分生组织向花器官的转变;同时AP1基因又是花器官形态特征基因,在花发育的ABCDE模型中,AP1基因属于A类基因,是萼片和花瓣正常发育所必需的。本研究通过RACE方法克隆三白草的MADS-box AP1基因的cDNA全长并与其他物种的AP1同源基因C-末端的结构域进行比较,同时对AP1 MADS-box基因在苞叶变化过程中表达进行分析,无被花三白草的研究对正确了解花被起源和演化过程具有重要的意义。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

筇竹QtKAT1基因的克隆与表达分析

为探究竹类植物K+调控机理及K+通道的系统,本研究以筇竹(Qiongzhuea tumidinoda)为试验材料,对筇竹QtKAT1基因分离克隆及表达分析.通过克隆获得筇竹QtKAT1基因,全长为3 124bp,含2 235 bp的最大开放阅读框,编码744个氨基酸.生物信息学分析表明QtKAT1基因预测编码蛋白分子质...     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库,选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列,利用电子延伸和RT-PCR方法,获得一个开放阅读框为1 434 bp,编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸）,但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350）,因此,将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明,TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示,TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应,但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h,基因的表达量已达到对照的30倍,之后其表达量迅速回落,但仍高于对照;受ABA诱导时,其表达量略有增加,在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。