甘蓝SCR识别与结合SRK胞外域核心编码区DNA序列的酵母双杂交检测

SCR是芸薹属自交不亲和性的雄性决定因子。为研究SCR与SRK之间相互作用的核心区段,通过构建结球甘蓝的包含系列不同长度的SCR的cDNA序列的pGBKT7融合载体,利用酵母双杂交系统检测SCR与SRK之间的相互作用。结果显示,构建的载体均未出现自激活现象,所获得SCR全长与其相对应SRK胞外域具有相互作用,且相互作用核心编码区位于SCR编码基因的第97~186 bp处。实验结果还显示,此单倍型的SCR信号肽剪切位点及相邻的几个氨基酸残基对相互作用实验结果有干扰作用。以上结论为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和机制的研究提供了新的实验依据。     

甘蓝自交不亲和信号传导中THL1和SRK相互作用的体外检测

在甘蓝自交不亲和信号传导中SRK和THL1之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用, 以甘蓝E1为材料, 采用RT-PCR技术扩增了THL1和SRK激酶结构域(记为SRK_E1)编码序列, 构建了THL1原核表达质粒pET43.1-THL1, SRK_E1原核表达质粒pET431-SRK_E1和真核表达质粒pPIC9K-SRK_E1, 分别在宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。THL1融合蛋白经胰岛素检测, 表明表达的THL1有氧化还原活性。建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对THL1与SRK_E1的相互作用进行了检测, 结果表明THL1可与SRK_E1相互作用并形成稳定的复合体, 这为深入分析THL1与SRK相互作用机理提供了理论和技术基础。     

甘蓝自交不亲和信号传导中SRK底物ARC1蛋白编码序列的克隆与分析

以甘蓝自交不亲和系20010197的植株为材料，提取幼苗中的gDNA及花蕾期的柱头、子房、花瓣、叶片、根的mRNA，并对mRNA进行反转录合成cDNA，然后以gDNA与cDNA为模板扩增ARC1蛋白编码序列。结果表明只在gDNA与花期柱头mRNA的反转录cDNA中扩增出产物，而在其他组织中无任何产物。这可能说明甘蓝ARC1蛋白编码序列是在柱头特异性表     

甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1的体外表达及其与SRK相互作用验证

在甘蓝自交不亲和信号传导中ARC1和上游因子SRK之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增ARC1的编码序列, 构建ARC1原核表达质粒pET43.1a-ARC1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-ARC1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni⁺结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对ARC1与SRK的相互作用进行了检测。结果表明,在体外ARC1能与SRK相互作用并形成复合体,这为深入分析ARC1与SRK相互作用机理以及探讨ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。     

拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

利用酵母双杂交系统筛选大豆结瘤因子受体NFR1α的互作蛋白

大豆是重要的植物蛋白作物和粮豆间作作物,挖掘大豆的生物固氮潜力,对推动生态农业的可持续发展具有深远意义。大豆结瘤因子受体蛋白GmNFR1?(Nod Factor Receptor)对结瘤至关重要,但其具体调控机制尚不明确。本研究以大豆mRNA为模板,利用RT-PCR方法扩增到GmNFR1?蛋白的激酶结构域(GmNFR1?-pk),构建了pGBKT7-GmNFR1?-pk诱饵表达载体,通过酵母双杂交技术,筛选大豆根瘤AD-cDNA文库,从文库中分离到与GmNFR1?-pk相互作用的71个阳性克隆,经测序和同源性分析筛选到12种与GmNFR1?-pk互作的蛋白,包括钙离子结合手性蛋白、豆血红蛋白、结瘤素Nod44等蛋白。以大豆豆血红蛋白GmLbc2为例,回转酵母以及烟草体内BiFC验证其与诱饵蛋白的相互作用,对其进行同源蛋白比对及系统进化树分析,并利用百脉根毛根转化技术鉴定GmLbc2在结瘤过程中的生物学功能。研究结果进一步补充和完善了GmNFR1?介导的结瘤信号传递途径,为大豆与根瘤菌共生互作机制提供了新的分子证据。     

月季酵母双杂交cDNA文库的构建及RhRD22互作蛋白的筛选

月季(Rosahy brida)是全球重要的观赏植物,其生长发育和生产质量严重受到干旱胁迫的制约.在已有月季转录组数据的基础上,干旱胁迫可以诱导干旱响应基因RD22(dehydration-responsive gene RD22)的表达.为了进一步探究RhRD22参与干旱胁迫的分子机制,本研究利用改良的SMART(S...     

甘蓝eSRK重组体的构建及其与SCR的相互作用

SRK与SCR是甘蓝自交不亲和雌雄性决定因子,两者间相互作具有单倍型特异性。为了探讨HVI/II区域在SRK单倍型特异性及其与SCR互作中的作用,采用重组技术构建甘蓝不同单倍型eSRK (SRK_E与SRK_F)间的重组体eSRK_E-1、eSRK_E-2和eSRK_E-3,用酵母双杂交系统3检测各eSRK重组体与SCR之间的相互作用。结果表明: (1) SCR_E能与eSRK_E作用,而不能与eSRK_F作用,说明eSRK_E、eSRK_F属于不同单倍型;(2) SCR_E与重组体eSRK_E-1、eSRK_E-2、eSRK_E-3均不发生作用,HVI和HVII区域内差异的氨基酸位点共同参与了与SCR的作用;(3) SCR_F不能与eSRK_E-1、eSRK_E-2、eSRK_E-3作用,替换HVI/II区域后并不能改变SRK的单倍型。     

甘蓝BoExo70A1与BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测

Exo70A1是芸薹属作物柱头接受亲和花粉的必需因子,可能参与了干性柱头水分分泌和花粉水合过程。本文从自交不亲和甘蓝A1柱头c DNA中获取了Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因的编码序列,序列分析表明,Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因分别与At Exo70A1、At SEC3A、At SEC10、At SEC15B和At Exo84B基因的c DNA序列高度同源,其编码的5个蛋白均没有信号肽,Bo SEC3蛋白含有一个典型的EF-hand钙离子结合结构域。将Bo Exo84蛋白拆分为2个片段(Bo Exo84-N和Bo Exo84-C),并与Bo SEC3、Bo SEC10和Bo SEC15蛋白编码序列一起分别亚克隆至p GADT7质粒,Bo Exo70A1蛋白编码序列亚克隆至p GBKT7质粒,酵母双杂交检测结果表明,Bo Exo70A1蛋白能与Bo SEC3、Bo Exo84-N蛋白互作,但不能与Bo SEC10、Bo SEC15蛋白互作,这为深入探讨Bo Exo70A1蛋白乃至整个胞泌复合体在甘蓝干性柱头接受自花花粉排斥异花花粉过程中的作用机制提供了依据。     

甘蓝自交不亲和性信号传导元件与传导过程

甘蓝自交不亲和性是由多态性的S位点基因编码的蛋白质介导的信号传导途径实现的。该信号传导途径由8个蛋白质元件(SLG、SCR、SRK、MLPK、THL、ARC1、Exo70A1和MOD/MIP-MOD)组成,本文详细综述了这些元件的编码基因、蛋白质元件的结构和功能,以及元件间的相互作用所构成的信号传导过程。在此基础上,根据新进展提出了今后可能的研究重点,以期为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和性的深入研究提供新的内容。     

槲皮素对SI甘蓝授粉引起的PK活性及相关指标的影响

通过槲皮素处理,研究了自交不亲和甘蓝自花授粉和异花授粉与蛋白激酶的关系。结果表明,槲皮素能明显抑制自交不亲和甘蓝自花授粉引起的蛋白激酶活性,导致蛋白质磷酸化明显受阻,进而促进自花诱导的花粉萌发和花粉管生长,同时使SOD、POD、CAT活性升高,Ca2+含量下降,Ca2+在胞内的分布明显改变,而槲皮素对异花授粉抑制作     

甘蓝S-位点基因SRK、SLG和SP11/SCR密码子偏好性分析

S位点是芸薹属植物自交不亲和反应的关键位点,控制自交不亲和反应的识别与启动。为明确甘蓝S位点基因SRK和SLG的S域和SP11/SCR编码序列密码子的使用特性,利用Codon W、SPSS软件、Python程序和EMBOSS在线程序分析甘蓝41个SRK、36个SLG和11个SP11/SCR等位基因的偏好性,同时通过中性绘图、ENC-GC3绘图、PR2绘图及多元统计分析探讨基因密码子偏好性形成原因,并利用不同方法对其进行聚类分析。结果表明,甘蓝SRK、SLG和SP11/SCR基因编码序列富含A/T,密码子偏好以A/T碱基结尾,偏好性较低。自然选择是影响密码子使用模式的主要因素,突变压力为次要因素,还受到二核苷酸丰度的影响。根据RSCU值发现, SRK和SLG基因高表现密码子有4个, SP11/SCR基因有11个。基于RSCU的聚类能够较准确地反应甘蓝SRK、SLG和SP11/SCR等位基因间的关系,并与基于CDS核酸序列的聚类具有一致性和可靠性。根据密码子使用偏好性和聚类关系发现, SRK的S域和SP11/SCR编码序列在密码子偏好性上可能是协同进化的。这为更好理解甘蓝中密码子的分布机制...     

甘蓝自交不亲和系柱头和花粉粒不亲 和互作的电镜扫描研究

扫描电镜观察到甘蓝(Brassica oleracea L.)自交不亲和系02-E1柱头上不能萌发的花粉在授粉后18小时内就会萎缩变小直至干瘪。能够萌发的花粉从一个萌发沟萌发后，另外两个萌发沟就自动萎缩，其花粉管有的扭曲不能伸入乳突细胞，仅少量花粉管能伸长进入花柱。经过5%NaCl溶液处理后的甘蓝自交不亲和系的柱头表膜乳突细胞或皱缩或破裂，花粉粒很容易萌发并长出花粉管，然后花粉管穿破乳突细胞壁而伸入花柱完成受精作用。     

结球甘蓝雌蕊调控因子SPT与HEC1的克隆及相互作用分析

为研究SPT和HECs及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响, 以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料, 提取雌蕊总RNA, 根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物, 采用同源克隆的方法克隆SPT基因, 其序列1085 bp, 开放阅读框(ORF) 1062 bp; HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明, SPT编码353个氨基酸残基, 预测分子量为37.67 kD, pI为6.83; HEC1编码231个氨基酸残基, 预测分子量为25.26 kD, pI为10.2。分析表明, 两基因在各器官中均表达, 但SPT在果实和雌蕊中表达量最高, 而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用, 构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1, Pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体, 分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象, 融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑, 表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因, 酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致, 说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。