人胰岛素原基因转染绵羊成纤维细胞及细胞株的建立

从动物耳皮肤组织采样 ,采用将组织块剪碎后直接贴附于培养瓶底部的方法进行原代培养 ,该方法使原代细胞出现率及可传代率均达到 10 0 %。根据上皮样细胞和成纤维样细胞贴壁紧实程度的不同 ,用 0 .0 5 %的胰蛋白酶-EDTA对其进行消化 ,可将两种不同类型的细胞进行分离和纯化。通过脂质体介导 ,以BLG -hINS(含乳球蛋白调控基因的人胰岛素原基因 )基因作为目的基因、GFP(绿色荧光蛋白 )基因作为标记基因共转染绵羊成纤维细胞 ,经G - 4 18筛选后 ,得到转染细胞。对转染的细胞分别用单细胞显微操作法和有限稀释法进行细胞克隆 ,两种方法均可得到克隆细胞。选形态正常、生长均匀的 5个细胞克隆进行PCR检测 ,结果 5个克隆均转有GFP基因 ,其中两个转有BLG -hINS基因。高代培养细胞、转染细胞和克隆细胞经核型分析后 ,染色体数目均为 2 7对 ,表明绵羊耳的成纤维细胞建立细胞株后 ,可以作为外源基因转染的有效供体细胞。     

牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻、解冻后细胞可继续传代     

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染.克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体.用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24 h后观察荧光表达,48 h后加入600μg·mL-1 G418,筛选1周,300 p.g·mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养.对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析.结果,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEGFP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1500 bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体.说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性.可以作为核移植进行转基因克隆牛研究.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

研究了不同胎龄、消化液、培养液对转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离和培养的影响,并对其生长形态进行观察。结果表明,在实验室条件下,12.5～14.5d胎龄的GFP-MEF分离效果最好,0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高;GFP-MEF形态以小梭形为主,呈漩涡状、鱼群状生长;最佳培养液为DMEM添加10%胎牛血清。研究获得了实验室分离制备GFP-MEF的方法,为制作饲养层和进一步构建转基因动物奠定基础。     

绿色荧光蛋白在鸡胚成纤维细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pEGFP-C1转染到培养至第二代的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,同时使用活体DNA染料Hoechst3334(2H342)对CEF细胞核荧光染色,通过荧光倒置显微镜和RT-PCR方法检测GFP的表达产物。在荧光倒置显微镜下可见CEF的胞质和核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质,在H342作用下,细胞核呈现蓝色荧光;转染细胞中转录产物经RT-PCR扩增后,在凝胶上可见与GFP基因片段分子量大小一致的条带。可见,GFP基因可以被转染至CEF中,并在CEF中表达。     

带有绿色荧光蛋白外源DNA转染绵羊成纤维细胞的研究

为了优化建立转染绵羊成纤维细胞系的外源基因转染体系,本研究利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的外源基因,采用阳离子脂质体法,探讨了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊成纤维细胞的影响。结果表明,在500 μL转染培养基中成纤维细胞达到85%汇合时,添加由50 μL DMEM中含有0.2 μg DNA和50 μL DMEM中含有2.0 μL LipofectamineTM 2000的两种溶液混合构成的转染液并转染12 h,可获得最高的转染效率。当转染12 h后,用基础培养液培养至第24小时,细胞核周区出现强绿色荧光,而当转染后48～64 h观察时,细胞核周区的荧光强度明显弱,而远离核周区的胞质中的荧光强度增加。     

绵羊主基因的研究进展

本文主要就绵羊的Callipyge基因、FecB基因及FecX基因的遗传方式、效应、作用机理等的研究进展进行综述 ,并进一步探讨它们在生产实践中的应用     

猪输卵管上皮细胞、颗粒细胞、耳上皮细胞及胎儿成纤维细胞的培养

本文培养了猪输卵管上皮细胞、颗粒细胞、耳上皮细胞、胎儿成纤维细胞等几种细胞 ,比较了几种细胞原代和传代培养的特点 ,发现原代培养时猪耳组织、胎儿组织消化后的单细胞和剩余细胞团块一起培养 ,其生长速度较单个细胞快。 4种细胞中颗粒细胞体积最大 ,生长速度最慢 ,传代密度须保持 2× 10 5 ml以上为宜。     

转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选

为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采用脂质体介导法转染绵羊成纤维细胞,通过药物筛选、阳性细胞鉴定及体外培养等方法,获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊成纤维细胞株.结果,用pcDNA3.1-K2.10-4S表达载体转染冷冻复苏的绵羊成纤维细胞后,利用G418筛选法获得neo基因的抗性细胞,即阳性细胞;采用PCR方法对阳性细胞鉴定显示,所构建的载体整合到了细胞基凶组中;对阳性细胞的染色体核型分析显示,阳性细胞核型稳定,与正常细胞的核型无差异;阳性细胞经冷冻复苏后仍能保持原有的特性.该细胞株的建立为进一步开展转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究奠定了基础.     

蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析

本研究以蒙古绵羊胎儿为材料,进行了胎儿性别鉴定,结果显示为雄性。取其皮肤组织进行离体培养,对所获得的细胞进行纯化,筛选出成纤维细胞。通过形态观察发现,在10代以内,细胞形态良好,随着代数增加梭型细胞有拉长趋势,在第20代时梭形明显拉长,单位面积细胞数目大量减少;同时做了F5、F10代细胞的生长曲线,发现随着代数的增长,细胞生长力略有下降,但趋势不明显;对F5、F10代细胞做了核型分析,二倍体比率分别为85.71%和76.67%,这满足了作为核移植供体细胞的要求;细胞冻存后复苏贴壁情况良好。     

中国6个地方猪种与3个外种猪氟烷基因PCR产物序列比较研究

本文应用PCR方法 ,体外扩增了中国地方猪和外种猪共 16个个体的氟烷基因 1814 9～ 1876 0位之间 6 12bp的片段 (包含完整的外显子 17和cDNAC1843 →T1843 突变位点 ) ,并进行了序列测定。结合网上下载的 5个中外猪种相同区段的序列进行了比较研究。结果表明 ,本文所测序列比网上公布的序列少 2bp ,在 1815 3,1815 4处有两胞嘧啶(C)缺失 ;皮特兰猪在cDNA的C1843 位点存在C1843 →T1843 突变 ;6 12bp的片段中共有 14个变异位点 ,皆为转换型突变 ,内含子 16中有 3个位点存在转换型杂合子 ;所有突变中 ,有 4处发生在外显子 17内 ,除香猪和皮特兰猪外均为同义突变 ;这些变异位点共形成 12种单倍型 ,其中扩增片段 5 14位 (全序列中为 186 6 2位 )的C→T突变为内江猪独有 ,构成了内江猪独特的单倍型 ,C18662 →T18662 突变具有品种特异性     

氨基酸对基因表达的影响

氨基酸除了作为蛋白质合成底物外 ,氨基酸在体内还发挥着其它重要的营养生理功能 ,例如作为糖异生的底物、作为神经递质和信号转导的前体及蛋白质周转的调节剂等。然而 ,大量研究证实氨基酸还作为营养信号分子调控着许多调节细胞功能和氨基酸代谢的基因的表达。氨基酸主要是通过影响DNA的转录和mRNA的稳定性和翻译而调控基因的表达。但是 ,氨基酸调控基因表达的分子机制仍然不十分清楚     

白来航蛋鸡与丝羽乌骨鸡及其杂交后代卵巢组织的基因表达差异研究

白来航蛋鸡与丝羽乌骨鸡杂交 ,正反交组合鸡群 32周龄产蛋数的杂种优势率分别为 12 .2 %和 2 1.6 1%。mRNA差异显示研究表明 :产蛋高峰期 (32周龄 )卵巢组织的基因表达在杂种群与亲本纯种群之间存在显著的质和量的差异 ;8对引物组合显示出 91条 (31.2 7% )差异带 ;分属于 7类 2 2种基因差异表达模式 ,其中量的差异有 3类 8种。这些基因差异表达模式的存在说明了杂种的基因表达调控方式发生了变化 ,这必然与正反交组合鸡群具有较高的杂种优势率有关 ,或是mRNA水平上杂种优势形成的分子遗传基础。     

猪肝脏HMG-CoA还原酶基因的部分序列克隆及分析

从杜长嘉猪的肝脏中提取基因组RNA ,进行反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,获得 1条近 175bp的片段 ,克隆于pUCm TVector后进行序列分析结果表明 ,该片段为HMG CoA还原酶催化域cDNA的部分序列 ,与GenBank登录的序列基本一致     

乌骨绵羊和非乌骨绵羊血液生理生化指标的比较研究

为探索乌骨绵羊乌质性状的形成机制,本文比较了乌骨绵羊、兰坪本地非乌骨绵羊和罗姆尼羊血液酪氨酸酶含量、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、抗超氧阴离子活力、肝功能、肾功能和免疫等指标。初步发现乌骨绵羊具有高的酪氨酸酶含量、抗氧化能力和免疫机能。指出乌骨绵羊乌质性状的形成可能是由于高含量的酪氨酸酶催化合成了高含量的真黑色素沉积在肌肉和其他组织与器官。     

生长激素受体缺失对伴性矮小型公鸡精液品质的影响

以伴性矮小型公鸡和普通杂合子型公鸡为研究材料,就生长激素受体(GHR)基因的缺失对公鸡精液品质的影响进行研究。结果表明:2种基因型初生雏鸡的体重相差无几,但4、8、16周龄和20周龄的体重差异极显著(P<0.01);8周龄胫长差异极显著(P<0.01)。性成熟后,伴性矮小型公鸡的精液密度为26.17亿/mL,略低于普通杂合子型公鸡(29.87亿/mL),但差异不显著;伴性矮小型公鸡的精子活率、活力和畸形率等指标与普通杂合子型公鸡相近,差异均不显著(P>0.05)。试验结果证明,生长激素受体缺失对伴性矮小型公鸡繁殖性能没有影响。     

乳酸菌类微生态制剂及其微胶囊化的研究进展

乳酸菌在体内发挥着重要的生理生化作用 ,但是该类微生态制剂的抗逆性较差。微胶囊技术是当今世界发展迅速、用途广泛的一种技术 ,它能较好地提高细菌存活率。本文就乳酸菌类微生态制剂的生理作用及微胶囊技术在该制剂上的应用作简要综述 ,以期加深对微胶囊技术的认识 ,并推动该技术在饲料添加剂中的应用