西瓜NBS类同源序列的克隆与分析(摘要)

R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分,在目前已经发现的植物抗病基因中,NBSLRR类占了绝大多数,在植物抗病基因中占有重要地位。NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分,含有8个保守基序,包括P-loop(又称Kinase-1a)、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。对西瓜NBS的克隆和分析将有助于筛选西瓜抗病基因及各种抗病基因的分子标记,而且通过对西瓜NBS的结构、表达和调控的研究,将有助于深入阐释西瓜的抗病机制。以根结线虫抗病西瓜材料‘红籽瓜’和感病西瓜材料‘ZDPI0006’为试材,根据西瓜NBS保守区设计简并引物及特异引物50对,根据葫芦科抗病基因序列在西瓜基因组数据库搜索同源序列,并以此设计特异引物1对,分别提取西瓜叶片g DNA和RNA并反转录成c DNA,采用PCR扩增西瓜抗病基因同源序列,琼脂糖电泳检测回收目标条带,克隆测序后结果提交到Gene Bank进行序列比对,提交至Pfam在线分析蛋白质功能,利用Clustalx与其他物种的抗病基因进行同源性分析,利用dnasp等软件进行序列多态性分析。结果表明,49对引物中共有43对引物在抗、感材料中成功扩增到目的片段,其中有4对引物在抗感材料中扩增出差异片段,简并引物W856在抗、感材料间扩增到一条约750bp的差异片段,测序结果提交至NCBI比对显示其与预测的黄瓜抗TMV的N端类似蛋白存在88%的同源性,根据葫芦科抗病基因在西瓜基因组数据库搜索同源序列设计的特异引物W6580在抗、感材料间扩增出大小一致的约800bp的片段,测序结果提交至NCBI比对,结果显示其与预测的黄瓜抗线虫类似蛋白存在90%的同源性,dnasp软件分析显示抗、感材料之间存在4个单核苷酸多态性位点。     

RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展

RGA克隆法是利用抗病基因产物的保守结构域人工设计简并引物,以植物gDNA或cDNA为模板进行PCR扩增而克隆植物抗病基因同源序列的方法。随着各种植物基因组测序计划的完成及计算机和生物信息学的发展,植物抗病基因的克隆取得了很大进展,目前人们已经从植物中克隆得到100多个抗病基因。研究表明,大多数抗病基因都存在NBS-LRR、STK、LZ、TIR等功能保守的结构域,其中大部分都为NBS-LRR类型,利用NBS-LRR保守结构域设计PCR引物已经从植物中扩增出大量的RGA。简要综述了已克隆NBS-LRR类抗病基因的结构特点和功能、RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展,并探讨其未来的发展与应用。     

菠菜NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

依据已知NBS-LRR类抗病基因的P-loop和GLPL两个保守结构域设计简并引物,对抗菠菜霜霉病商业杂交种RZ51-147、自交系12S3和12S4的基因组DNA进行PCR扩增、克隆和序列测定,共获得23条具有完整开放阅读框且含有NBS结构的抗病基因同源序列(resistancegeneanalogs,RGAs),编号为SP1~SP17、SP19~SP24,其在NCBI中的登录号为KX914865~KX914887。核苷酸比较分析结果表明,这23条RGAs大多与甜菜中推测的一些抗病蛋白基因或其他相关蛋白基因具有较高的同源性,其中SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13等8条序列均与甜菜RF45类抗病蛋白有着86%以上的同源性;SP3、SP4、SP8、SP9、SP24等5条序列与甜菜RPP13类抗病蛋白的同源性在85%以上,与向日葵抗霜霉病基因PI8相应区域的氨基酸序列相似性为32.20%~33.52%,且在进化树上聚为一类,推测其可能与抗霜霉病相关。同源进化分析结果表明,除SP7外,其余序列均为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,并与推导的氨基酸序列多重比较结果一致。     

利用模糊搜索获得柑橘全基因组抗病基因同源序列的初步研究

本研究利用模糊搜索的方法,在2个柑橘基因组数据库中搜索到了3 731条柑橘抗病基因同源序列,并根据已知的注释信息对将其归为两类。这对研究柑橘抗病基因同源序列的分布及多样性具有重要意义。     

黄瓜NBS类抗病基因类似物的生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对黄瓜NBS类抗病基因类似物(RGA基因)进行生物信息学分析,以预测RGA基因编码产物的理化性质、结构与功能,为进一步研究黄瓜抗病调控机制提供一定的理论依据。结果表明:RGA基因编码产物为一个长度达84个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10 964.32Da,理论等电点为PI 9.36,不存在跨膜区域,主要定位在细胞质中;进化比对表明,黄瓜的NBS类抗病基因在亲缘关系上与西瓜最近,其次是丝瓜;二级结构为α-β型,具有较为明显的3个螺旋和2个折叠;具有酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点3个功能位点;预测RGA基因编码产物主要充当辅酶角色参与生化反应的调控,介导基因表达调控,在抗逆相关的信号通路以及种子胚的发育等过程中发挥重要的生理功能。     

番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。     

果树R基因同源序列克隆的初步研究

用2对根据已知植物抗病基因(R基因)编码的蛋白质的NBS保守区而设计的特异简并引物,对荔枝、龙眼、芦柑、柚子及银杏的基因组DNA进行体外扩增.其中一对引物(P1/P2)在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中获得的扩增产物均表现为一条大小约500bp的明亮谱带,而银杏扩增产物的亮带则在约750bp处,且弥散在400 ～ 1000bp之间.另一对引物在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中没有特异扩增带,而在银杏中获得了一条400 ～ 600bp的较亮的宽带.将荔枝、龙眼、芦柑和柚子的500bp特异扩增带以及银杏的400 ～ 600bp条带回收克隆,并分别筛选几类阳性克隆进行测序.共获得15个片段的序列.经比较发现,来自荔枝、龙眼、芦柑和柚子的12个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列的一致性为15.5% ～ 47.1%;而3个来自银杏的片段均不是RGA,其中1个与反转录酶有较高的同源性,另2个在GeneBank中没有找到同源序列.该结果显示,应用同源扩增技术克隆果树RGA是可行的,但银杏作为古老的裸子植物,其抗病基因的结构与现代物种可能有很大差异.     

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10（含抗晚疫病基因R10）、四倍体马铃薯栽培种Katahdin（不含已知抗病基因）及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记：RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10(含抗晚疫病基因R10)、四倍体马铃薯栽培种Katahdin(不含已知抗病基因)及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记： RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

与黄瓜抗炭疽病相关基因连锁的AFLP标记的筛选

以黄瓜抗炭疽病母本66和感炭疽病父本A18及其F₂代分离群体为试材, 采用BSA法和AFLP技术建立了对炭疽病的抗病组和感病组, AFLP引物组合E24M48在抗感组间表现多态性, 且呈共显性。经220个F₂单株分析, 在高抗单株和高感单株中分别仅扩增出251 bp和245 bp的特异片段, 而在中间类型个体中同时扩增出了该两个特异片段。连锁值测定结果表明, 该特异带与黄瓜炭疽病抗病相关基因紧密连锁,距离为21727 cM。测序结果显示, 该两个片段的大小分别为251 bp和245 bp, 并且两个片段的差异在于两个“TCT”重复序列(6个碱基) 的插入或缺失。     

华东葡萄抗白粉病杂种后代cDNA文库的构建及EST序列分析

以抗白粉病的华东葡萄杂种后代6-12-4株系为试材,利用SMARTTM技术构建了白粉病病原菌诱导的全长cDNA文库。经检测,原始文库滴度为2.50×106pfu·mL-1,重组率达到99%,扩增文库滴度为3.0×109pfu·mL-1,重组率达到95%,插入片段长度在500～2000bp。随机挑取300个克隆,测序获得260条质量较高的ESTs,聚类及拼接后,共得到183个一致序列(所获序列已经提交GenBank,登录号为FG579859-FG580039)。经蛋白功能预测分析,获得含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白、MYB类转录因子、水通道蛋白、富含脯氨酸蛋白、亲环素蛋白、ACI14蛋白、转脂蛋白等抗病相关基因,涉及到植物的信号转导,胁迫诱导,防卫反应等方面。这些EST序列为利用中国野生华东葡萄进行抗白粉病育种研究和利用提供了有价值的抗病基因片段,为丰富世界葡萄属植物抗白粉病基因提供序列数据。     

转chit42基因柠檬的分子鉴定及抗炭疽病研究

以转chit42基因柠檬为试材,对其进行了分子鉴定和抗炭疽病研究。用PCR和Southern杂交证实外源基因chit42已经整合到转化植株基因组中,chit42基因在转基因柠檬SR23株系中为3个拷贝,在SR24株系中为2个拷贝。对转基因柠檬进行离体和活体抗炭疽病试验表明转基因柠檬抗炭疽病能力得到明显提高。利用半定量RT-PCR技术检测chit42基因在柠檬中的表达,结果表明用炭疽病病菌接种处理24h后,chit42基因表达量开始增加;接种48h后,chit42基因表达量进一步明显增大;接种72h后,表达量开始有所下降,但仍然高于正常情况下chit42基因的表达量。     

核桃FRUITFULL(JrFUL)基因的克隆及表达分析

【目的】研究核桃JrFUL基因的序列特征及在核桃雌雄异熟开花机制中的作用。【方法】以核桃雌先型品种‘极早丰’及雄先型品种‘新早丰’的雌雄花芽为材料,外部形态测量确定不同品种核桃雌雄花芽形态分化差异。通过qRTPCR技术,分析核桃JrFUL、JrAP1、JrLFY及JrSOC1基因在两个核桃品种不同发育时期的雌、雄花芽中的表达模式。克隆核桃JrFUL基因CDS序列,对其结构进行分析。【结果】春季萌芽期后,2月26日雌、雄花芽的横、纵径逐渐开始出现显著差异。不同核桃品种同一时期的雌、雄花芽的几个基因表达量有所差异。克隆得到的核桃JrFUL基因CDS编码区的全长序列长度为747 bp,命名为JrFUL,编码248个氨基酸。NCBI数据库Blast比对表明核桃JrFUL基因与其他植物物种FUL同源基因的相似性较高。系统进化分析发现核桃JrFUL与连香树及葡萄的FUL亲缘关系最近。【结论】JrFUL基因可能在核桃开花进程中起到关键作用,可能对雄花的开放有促进作用。JrLFY与JrSOC1基因可能一定程度上促进核桃开花,JrAP1基因可能一定程度上抑制核桃开花。     

杏NBS基因家族鉴定及其对果实抗病性的影响

[目的]探讨杏果实发育过程中NBS基因家族的表达规律,为果实抗病机制研究提供理论指导.[方法]运用生物信息学方法进行NBS基因家族鉴定与转录组分析.[结果]在串枝红杏基因组中共鉴定到155个NBS抗病基因,主要分为CNL型(126个)和NL型(29个),45％的基因主要分布在1号与2号染色体上,顺式作用元件较多且大多属...     

南瓜 NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

依据已克隆植物抗病基因的保守氨基酸结构域合成相应简并引物,通过PCR扩增从南瓜基因组DNA中分离了8条南瓜抗病基因同源序列,通过对其编码的氨基酸序列分析表明这些RGAs均含有P-loop及GLPL等植物抗病基因中的保守结构域.经BLAST分析表明,分离的南瓜RGAs与已报道的甜瓜等植物的RGAs有较高的同源性.南瓜RGA的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础,也为研究南瓜种质资源的起源与进化提供借鉴.     

枣E类MADS基因在花和果中的表达及其蛋白互作研究

以'金丝小枣'花和果实为试材进行E类MADS-box基因的生物信息、表达、亚细胞定位及蛋白互作研究.3个E-type MADS-box基因分别位于SEP1/2、SEP3和SEP4进化支.与其他物种的同源序列相比,E类蛋白在进化中非常保守.3个E类基因在枣的花和果实中均有表达,ZjSEP1/2在花不同发育时期表达比较稳定...     

园艺及园林观赏植物抗病基因类似物的研究进展

目前已从不同植物中分别克隆出70余个植物抗病基因.根据已克隆的抗病基因的结构特征,可分为4大类:NBS-LRR、STK、胞外LRR、STK与胞外LRR.对于园艺及园林观赏植物抗病基因同源序列(RGA)的研究已应用在基因克隆、分子标记、基因定位和基因进化中,但相关报道较少.RGA的分析,对于在果蔬生产及园林绿化上指导我们培育具有广谱性抗病的植物品种具有深远的意义.     

微毛樱桃NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及进化分析

【目的】原产于贵州雷公山的微毛樱桃(Cerasus clarofolia)种质对根瘤病具有很强的抗性,探索其亮氨酸重复核苷酸结合位点(nucleotide binding site-leucine rich repeat, NBS-LRR)抗病基因进化历程,为克隆樱桃根瘤病抗病基因提供基础。【方法】利用同源序列法从微毛樱桃基因组DNA中克隆NBS-LRR类抗病基因的同源序列,对序列特征、进化信息进行分析。【结果】共获得36条NBS-LRR,其中TIR类型24条、non-TIR类型12条。聚类结果显示,TIR与蔷薇科李属5条欧洲甜樱桃(Prunus avium)、17条桃(Prunus persica)、15条果梅(Prunus mume)、1条甘肃桃(Prunus kansuensis)的NBS-LRR序列聚在一支;non-TIR与李属物种甜樱桃、桃、果梅以及蔷薇科非李属物种白梨(Pyrus bretscheideri)、月季(Rosa chinnensis)的NBS-LRR序列聚在一支。Ka/Ks结果显示,微毛樱桃non-TIR类遭受正向选择,TIR类2个群组遭受纯化,1个群组遭受中性选择;TIR Ks频率远高于non-TIR,TIR Ks有两个分布范围,分别是0～0.3和0.8～1.2,non-TIR Ks在0～0.3;TIR Ks在0.1～0.2分布频率最高,non-TIR在0～0.1分布频率最高。【结论】获得的微毛樱桃NBS-LRR序列有TIR和non-TIR两种类型,系统进化树和Ks分析表明TIR可能更为古老,且微毛樱桃与桃、果梅的进化距离小于微毛樱桃与欧洲甜樱桃,TIR比non-TIR有更大规模的复制,都发生在较近的时期;non-TIR遭受正向选择,TIR遭受纯化和中性选择,TIR与non-TIR进化历程不同。     

通过农杆菌介导法将哈兹木霉几丁质酶ThEn-42基因导入核桃

 通过根癌农杆菌C₅₈C₁ ATHV Rif^R介导法, 利用烟草花叶病毒35 S 双启动子和苜蓿花叶病毒引导序列控制下的含抗新霉素磷酸转移酶基因(npt Ⅱ) 和哈兹木霉几丁质酶基因(ThEn-42) 的质粒pBin19ESR 为载体, 对3 个核桃体细胞胚系进行遗传转化, 结果获得41 个抗卡那霉素的体细胞胚系。经PCR 和复式PCR 检测, 41个转化系均含有nptⅡ基因, 其中38个转化系含有ThEn-42 基因。Southern 杂交分析表明, ThEn-42基因已被整合到核桃体的基因组中。几丁质酶活性检测结果表明, 转化的体细胞胚系的几丁质酶活性比对照高几十至几千倍。遗传转化的体细胞胚系已萌发成苗。     

甜瓜炭疽病病原菌鉴定

以南昌郊蛟桥镇甜瓜基地的甜瓜炭疽病病果为试材,采用致病性测定、形态学观察和分子生物学的方法,研究了甜瓜炭疽病病原归属。结果表明:黄瓜炭疽病病原菌形态具典型炭疽菌属类真菌Colletorichum orbiculare的特征,GPDH基因序列与NCBI-GenBank中已有的C.orbiculare序列同源性为100%,接种发病症状与自然发病症状类似,因此将该病原菌鉴定为瓜类刺盘孢(Colletorichum orbiculare)。