松材线虫RAPD-PCR反应体系的优化与分子鉴定标记的筛选

应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg2+浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响,旨在建立松材线虫的最佳反应体系,并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明:37℃的复性温度、3.0 mmol.L-1Mg2+、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1~25 ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系,通过对100个随机引物的分析,获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。     

松材线虫和拟松材线虫种间及种下群体的RAPD指纹分析

利用ＲＡＰＤ技术对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）和拟松材线虫（Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａ－ｔｕｓ）的分离物基因组ＤＮＡ进行了ＤＮＡ片段的随机扩增,以确定种间及种内群体的亲缘关系和筛选具有种鉴定特征的分子标记．通过对４０个１０聚体随机引物的筛选,应用８个引物对两种线虫种间及种内分离物扩增片段的遗传分析显示：两种间群体ＲＡＰＤ扩增片段的共享度为４０％～５６％,而在松材线虫的不同分离物之间的共享度为６０％～８４％;其中有一个引物（Ｐ２５３）可在松材线虫和拟松材线虫种间产生具有种鉴定特征的特异性ＲＡＰＤ片段,在松材线虫的不同分离物中均可产生一约７００ｂｐ的特异性片段,而在拟松材线虫中产生了两个分别约为１３００ｂｐ和１９００ｂｐ的特异性片段．     

松材线虫和拟松线虫种间及种下群体的RAPD指纹分析

利用ＲＡＰＤ技术对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｌｐｈｉｌｕｓ）和拟松材线虫（Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）的分离物基因组ＤＮＡ进行了ＤＮＡ片段的随机扩增,以确定种间及种内群体的亲缘关系和筛选具有种鉴定特征的分子标记。通过对４０个１０聚体随机引物的筛选,应用８个引物对两种线虫种间种内分离物扩增片段的遗传分析显示：两种间群体ＲＡＰＤ扩增片段的共享度为４０％￣５６％,百在松材线虫的不同分     

四川松材线虫与拟松材线虫的PCR-RFLP鉴别

应用PCR-RFLP技术对来自四川省8个地方的枯死松树样品中的伞滑刃属线虫(Bursaphelenchus)群体进行了分子鉴定。结果显示来自邻水、雅安的枯死松树样本中含有松材线虫(B.xylophilus),而来自大竹和遂宁的枯死松树样本中含有拟松材线虫(B.mucronatus)。其他伞滑刃属线虫包括莱鲁尔夫伞滑刃线虫(B.rainulf)、霍夫曼伞滑刃线虫(B.hofumanni)、泰国伞滑刃线虫(B.thailandae)、变异伞滑刃线虫(B.aberrans)。本研究中选用的4种限制性内切酶(DraⅠ、SalⅠ、HhaⅠ、AluⅠ)除SalⅠ外均可对所鉴定的这6种伞滑刃属线虫产生特异性的酶切位点,从而可均有效地鉴别出松材线虫、拟松材线虫和其他4种伞滑刃属线虫,其结果可为今后这几种伞滑刃属线虫的分子鉴定提供一定的参照。     

松材线虫和拟松材线虫的PCR快速检测

利用PCR技术对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus与拟松材线虫B．mucronatus的rDNA的ITS1区和5．8S区核甘酸序列扩增．根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别,分别设计出松材线虫和拟松材线虫的特异性引物,实现了单条活的或FG(φ为4％的甲醛)固定的松材线虫和拟松材线虫的快速检测．     

基于分子证据探讨松材线虫在中国的传播途径

采用11个随机引物对来自中国最早发病的5个省和日本疫区的松材线虫共10个居群进行遗传多样性分析和系统发育分析,拟从分子水平探讨松材线虫病在中国蔓延的可能途径.结果表明:中国松材线虫居群间存在明显的遗传差异,遗传距离为0.066～0.262;除了安徽明光的居群自成一支外,其他居群均与南京居群聚成一支,其中安徽皖南和浙江岱山居群与南京中山陵居群遗传距离最近,为0.066;安徽明光居群与南京居群的遗传距离最大,为0.262.表明发生在安徽皖南和浙江岱山等地的松材线虫病可能是由最早发病的南京地区扩散的;而发生在毗邻南京的安徽明光的松材线虫病不是由南京地区扩散的.该结果揭示,松木制品的调运等人为远距离传播是松材线虫在我国蔓延的主要途径之一.     

油菜RAPD最佳反应体系的初步构建

初步构建了油菜中RAPD扩增的最佳反应体系 ,结果表明 ,油菜的RAPD扩增最佳反应体系为 :在 2 0 μl的反应体系中 ,2 .0 μl 1 0倍的反应缓冲液、1 .2 μl 2 5mmol/LMgCl2 (终浓度为 1 .5mmol/L)、2 .0 μl1 .0mmol/LdNTPs(终浓度为 0 .1mmol/L)、0 .2 μl 5U/μl的Taq酶(每反应体系为 1 .0U)、2 .0 μl 5 μmolPrimer(终浓度为 0 .5 μmol/L)、6μlDNA(约 90ng)和6.6μlddH2 O。     

宁波松木中松材线虫与拟松材线虫混生现象的报道

在对宁波地区松木中携带的伞滑刃属线虫种类进行调查时,多次发现了松材线虫与拟松材线虫混生的现象,并进行了分子生物学方法的确认。     

辣椒RAPD反应体系研究

建立了辣椒PAPD反应体系，即在Williams等体系的基础上，以改进了的Ｐich和Ｓchubert的方法提取的DNA为底物，25μL反应混合物中含20ng DNA、1．5mmol/L MgCl2。利用该体系所获得的RAPD图谱重复性好、稳定性强。     

蓝莓RAPD反应体系的建立

以蓝莓幼嫩叶片为试材,采用CTAB法提取基因组DNA,并对影响RAPD反应的因素进行了研究,建立了适用于蓝莓的RAPD最佳反应体系。结果表明:从幼嫩的叶片中提取的DNA质量高;20lμRAPD-PCR体系中,退火温度37℃d、NTPs浓度0.25 mmol/L、模板DNA浓度0.5~1.5 ng/μl、引物浓度1 pmol/μlT、aq酶用量1.0 U时,获得的特异性谱带清晰可靠,可重复性高。     

杀松材线虫海洋细菌HT-11的鉴定及培养条件研究

[目的]从海洋中分离并筛选具有杀松材线虫活性的细菌。[方法]采用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行细菌分离,采用浸渍法测定菌株的杀线虫活性,并对筛选菌株的形态学、生理生化特性和16S r DNA序列进行测定,通过单因素试验筛选产生杀线虫活性物质的最适培养条件。[结果]共分离到36株海洋细菌,根据杀线虫活性筛选出1株具有高杀线虫活性的细菌HT-11。该菌株分离自牡蛎,其培养滤液处理松材线虫24 h的校正死亡率高达92.41%。根据形态学、生理生化特性和16S r DNA序列测定及其系统发育分析结果,将菌株HT-11鉴定为考克氏菌属(Kocuria)。单因素试验结果表明,该菌株在营养肉汤(NB)培养基中产生杀线虫活性物质的最适培养条件为:海水浓度100%,初始p H 7.0,培养温度25℃,培养时间3 d。[结论]该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。     

松材线虫传播机理的研究进展

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus主要靠媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus传播,并通过天牛造成的伤口侵入松树,因此,掌握松材线虫的传播机制,有助于了解线虫病的发生机理和发生规律。综述了松材线虫与其媒介昆虫关系研究的最新进展。     

基于ArcView的安徽省松材线虫病管理信息系统

以与安徽省松材线虫病疫情相关的空间数据和多项属性数据为基础,建立了以地区、县、乡三级区划为管理单元,具有信息查询、数据维护、信息存贮与管理、显示、输出等五大功能的计算机管理系统.     

松褐天牛成虫携带松材线虫的数量

研究表明,从松褐天牛羽化开始到结束,有８０％以上的天牛携逞松材线虫。每头天牛携带量平均在３５００条左右。６月份天牛羽化高峰。它所携带的松材线虫数量最多。雌成虫携逞量比雄成虫携带量多。感染松材线虫病病木１ｇ木材内的松材线虫数量约是１头松褐天牛所携带数量的４倍。１ｇ病木木材含松材线虫数平均２４６０２条。１头天牛携带５３５２条。松褐天牛小个体携带的松材线虫数比大个体的多。树干上羽化出的天牛携带松材线虫数多于树枝上羽化出的天牛携带量。     

松材线虫actin基因全长cDNA的克隆

借助电子克隆和RACE方法,克隆了松材线虫生长发育关键基因actin的全长cDNA序列(登陆号:EU100952)。该序列共1 296个碱基,有一个完整ORF,起始密码子在48位,终止密码子在1 176位,编码376个氨基酸。     

几种松树挥发物对松材线虫行为的影响

通过室内生测的方法,研究了几种主要的松树挥发物对松材线虫行为的影响.结果表明,α-异松油烯、β-水芹烯、β-蒎烯抑制松材线虫繁殖,其中α-异松油烯、β-水芹烯抑制力较强,β-蒎烯抑制力较弱,而β-月桂烯、反式-石竹烯、莰烯、异长叶烯和α-蒎烯对线虫繁殖没有影响.β-水芹烯和莰烯具有杀松材线虫活性,β-蒎烯和β-月桂烯增强松材线虫活力,而异长叶烯、α-蒎烯、反式-石竹烯对线虫存活没有影响.β-蒎烯、反式-石竹烯、异长叶烯、莰烯对松材线虫具引诱作用,其中β-蒎烯引诱力最强,反式-石竹烯次之,异长叶烯、莰烯引诱力最弱,而α-蒎烯、β-水芹烯、α-异松油烯和β-月桂烯对线虫无引诱作用.并对几种挥发物在松树抗松材线虫病中的作用进行了讨论.     

鱼藤酮及六种哒唑、咪唑类医用驱虫剂对松材线虫的作用

松材线虫是一种毁灭性的松林病害,发现有效的松材线虫杀虫剂是一项长期而艰巨的任务。测定了鱼藤酮及六种哒唑、咪唑类驱虫药对松材线虫的作用,发现鱼藤酮对松材线虫的杀灭效果远强于以乙酰胆碱酯酶为主要靶标的克线磷,鱼藤酮及阿苯哒唑、甲苯哒唑、氟苯哒唑、噢吩哒唑、磷酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑处理松材线虫120 h后的LC50分别为1.86μg/mL,2.11μg/mL,9.77μg/mL,5.38μg/mL,6.66μg/mL,1.14μg/mL和1.40μg/mL,其中线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮及呼吸代谢抑制剂阿苯哒唑、磷酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑对松材线虫表现出了出色的杀灭效果,松材线虫的呼吸代谢系统是松材线虫的敏感靶标。     

进境木片松材线虫PCR检测方法研究

利用松材线虫rDNA内转录区（ITS）特异性引物,对泉州口岸入境木片携带的线虫基因组DNA进行特异性PCR扩增,建立一套快速准确的线虫检测鉴定方法。将该检测方法应用于泉州口岸现场检疫鉴定,结果未检测到松材线虫,与传统形态学鉴定方法结果一致。