基于BSA分析法的分子标记基因定位技术在农作物中的应用

进行基因的标记定位有利于推动分子标记辅助育种在生产上的应用，同时它也可以为基因的图位克隆奠定基础。BSA（集团分离分析法，bulked segregation analysis）分析法是对基因进行标记定位的非常实用的方法，它首先利用从一对具有表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体构建具有目标性状差异的近等基因池，选择合适的分子标记对两基因池进行分子标记的筛选，筛选出的分子标记再经多个单株鉴定，从而找到与目标基因连锁的分子标记。可与BSA相结合用于基因定位的分子标记有多种，常用的分子标记有RFLP（限制性片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism），RAPD（随机扩增多态性DNA，Random Amplified Polymorphism DNA），AFLP（扩增片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorphism），SSR（简单重复序列，Simple Sequence Repeats）等，本文根据所用的分子标记种类对基于BSA分析法的基因定位技术进行了概述。     

AFLP-SCAR标记的开发及应用

为给小麦DNA指纹及基因或QTL定位等研究提供更多、更具有特异性的分子标记,将760条小麦AFLP(Amplification fragment length polymorphism)片段回收、克隆和测序,通过与美国农业部GrainGenes数据库中的DNA序列进行比对,在760条AFLP片段中有155条与GrainGenes中的片段高度同源,其余605条片段为新发现的小麦DNA序列.利用同一AFLP引物组合扩增的同长度片段的DNA序列差异设计了178对AFLP-SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)引物.115对引物在不同小麦品种中扩增出稳定清晰的多态性产物,其中46对引物在小麦品种间能够扩增出DNA片段长度多态性,可检测DNA位点59个,可在种子纯度鉴定、遗传作图和构建小麦DNA指纹等方面得到应用;另69对引物的扩增产物在品种间无长度多态性,但具有SNP多态性(Single nucleotide polymorphism).     

小麦AFLP_SCAR标记的开发及应用

为给小麦DNA指纹及基因或QTL定位等研究提供更多、更具有特异性的分子标记,将760条小麦AFLP（Amplification fragment length polymorphism）片段回收、克隆和测序,通过与美国农业部Grain-Genes数据库中的DNA序列进行比对,在760条AFLP片段中有155条与GrainGenes中的片段高度同源,其余605条片段为新发现的小麦DNA序列。利用同一AFLP引物组合扩增的同长度片段的DNA序列差异设计了178对AFLP-SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）引物。115对引物在不同小麦品种中扩增出稳定清晰的多态性产物,其中46对引物在小麦品种间能够扩增出DNA片段长度多态性,可检测DNA位点59个,可在种子纯度鉴定、遗传作图和构建小麦DNA指纹等方面得到应用;另69对引物的扩增产物在品种间无长度多态性,但具有SNP多态性（Single nucleotide polymorphism）。     

AFLP分子标记在小麦种质资源研究中的应用

AFLP(扩增性片段长度多态性 )是一种新的DNA分子标记 ,近年来广泛应用于小麦种质资源遗传多样性研究、种质指纹图谱构建及遗传材料鉴定、小麦遗传连锁图谱的构建、目的基因的分子定位、分子标记辅助选择以及基因表达调控与克隆研究等方面。本文对AFLP在小麦种质资源研究中的应用进展及前景进行了综述     

DNA分子标记在茶树种质资源鉴定中的应用

分子标记具有多态性高、检测手段简单迅速、无基因多效性、能够明确辨别等位基因、实验重复性好等优点。目前最常用的分子标记技术主要有限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）、随机扩增多态性DNA技术（randomom amplified polymorphic DNA，简称RAPD），微卫星DNA技术（inter—Simple Sequence Repeat，简称ISSR）、扩增片段长度多态性技术（Amplified Fragment Length Polymorphism，简称AFLP）等。分子标记技术在茶树研究中得到了广泛的应用，在茶树遗传多样性、种质资源保护、遗传图谱的构建、基因定位与辅助选择育种、指纹图谱应用于作物品种鉴定等研究方面均取得较好的应用效果。     

几种分子标记方法在杨树遗传研究上的应用

在概述分子遗传标记的基础上,综述了限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)、相关序列多态性分析(SRAP)、表达序列标签(EST)和单核苷酸多态性(SNP)几种分子标记的特点与应用概况.并综合国内外杨树遗传研究的现状,展望了其前景.     

玉米株高主效QTL qPH2.4的定位分析

课题组前期以玉米自交系郑58为轮回亲本,以昌7-2为供体亲本,通过分子标记辅助选择获得染色体单片段代换系Z12和W16。Z12和W16在bin2.07区域均含有1个来源于昌7-2的染色体片段,株高均显著高于轮回亲本郑58。利用郑58和Z12为材料构建F2分离群体,基于重测序和混合分离分析(BSA)策略,将株高主效QTL qPH2.4定位于第2染色体13.95 Mb(201 457 953~215 022 157 bp)的区域内。利用在目标区间内筛选出的20对多态性分子标记对包含743个单株的郑58×Z12 F2分离群体和包含1 720个单株的郑58×W16 F2分离群体进行基因型分析,结合田间株高数据进行QTL定位,将株高主效QTL qPH2.4定位在InDel分子标记ph-18和ph-19之间,区间的遗传距离为0.57 cM,物理距离为626 kb。参考B73基因组(RefGen_v4)注释信息,该区间内存在17个注释基因,其中,包含可以调控油菜素内酯信号的基因Zm00001d006677。     

小麦Wx-A1和Wx-D1位点的PCR分子标记

为了获得筛选低直链淀粉含量的分子标记,根据已知小麦Waxy基因序列设计PCR引物,通过在基因水平和蛋白质水平进行分离群体验证,建立分别专一检测Wx-A1位点和Wx-D1位点的PCR标记MAG264和MAG269。在分离群体中,MAG264标记能清楚地区分Wx-A1位点的三种不同基因型,呈共显性遗传。MAG269标记引物在野生型中扩增片段为1 400 bp,在突变型(Wx-D1bWx-D1b)中的扩增片段为800bp。但在分离群体中没有出现杂合体带型,从而使本应该表现为共显性的标记表现为显性遗传。MAG264和MAG269引物对DNA的扩增稳定性、重复性好。这些结果表明,本研究获得的Waxy基因分子标记可以用于小麦Waxy基因缺失类型的鉴定和糯质专用小麦的分子标记辅助选育。     

植物分子标记技术原理及其在茶树育种中的应用

本简述了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、任意引物PCR(Abitray Primer-PCR，APPCR)微卫星(microsatellite)或称简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)、简单重复间序列ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)、序列标签位点(sequence tagged site，STS)技术和割裂扩增多态性(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAPS)技术，扩增片段长度多态性(amplIfied fragment length polymorphism，AFLP)等植物分子标记技术原理，综述了该技术在茶树分类学及遗传多样性的研究、品种鉴定和亲缘关系鉴定、构建茶树的遗传图谱以及分子标记辅助育种等方面的应用现状。     

MFLP分子标记技术及其应用

微卫星锚锭片段长度多态性(MFLP)是建立在PCR技术基础上、结合了扩增片段长度多态性(AFLP)和微卫星锚锭引物技术(SSR-anchor primer)双重原理的新一代分子标记技术。与其他标记技术相比,MFLP具有分辨率高、重复性好、多态性强等优点。本文介绍了MFLP的原理、特点、技术流程,并阐述和讨论了其在遗传连锁图谱构建、目的基因定位、遗传多样性研究、标记辅助育种等方面的应用及前景,旨在为相关研究提供参考。     

茶树花发育相关的一个钙依赖蛋白激酶基因的克隆与表达分析

应用cDNA-AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技术分析了结实率差异显著的龙井43和大叶乌龙两个茶树品种在花蕾发育过程中基因表达的差异。从获得的差异图谱中,克隆得到一个与茶树花发育相关的钙依赖蛋白激酶基因片段,然后用RCAE方法扩增获得其cDNA全长序列,命名为茶树TCK(Camellia sinensis calcium-dependent protein kinase)基因,GenBank登录号EU732607。该基因cDNA序列全长2281bp,编码760个氨基酸。用RT-PCR方法进一步研究该基因的功能,检测其表达特异性,结果表明该基因只在茶树花蕾发育后期特异表达,在叶、花蕾发育早期均无表达,提示TCK基因可能在茶树花发育过程中发挥重要作用。     

甘蔗种质资源AFLP研究的引物筛选

以两个甘蔗品种ROC25和ROC23的基因组DNA为模板,利用AFLP技术从110对引物中筛选出5对带型分布均匀、多态性丰富且分辨能力强的选择性引物。5对引物分别是E2/M4,E4/M5,E5/M6,E11/M7和E2/M6,它们将为以后AFLP技术应用于甘蔗遗传研究提供参考。     

AFLP分子标记技术及其在茶树上的应用

本文介绍了AFLP分子标记技术的基本原理、特点和技术流程。对AFLP分子标记在茶树种质资源鉴定与分类、遗传多样性、亲缘关系的建立和遗传图谱的构建等方面的应用进行了概述，并对其存在的问题和在茶树领域的应用前景进行了分析。     

甘蓝型油菜硫苷含量性状的SSR连锁标记

以硫苷性状差异很大而其它品质性状和农艺性状相近的油菜品系967H和967L及其F1、F2植株为材料,通过建立高硫苷和低硫苷亲本基因池来筛选表现差异的SSR引物,利用差异SSR引物对F2代植株硫苷含量性状进行标记分析,确定其与硫苷性状相连锁的关系。结果表明,SSR引物CB10364与硫苷性状连锁,连锁相关性达极显著水平（F=46.32,p〈0.001）;单因素方差分析表明,标记CB10364对低硫苷性状的贡献率为34.36%。     

AFLP的原理及其应用

ＡＦＬＰ是检测ＤＮＡ多态性的一种新的分子标记技术。对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述     

Evaluation of Simple Sequence Repeat (SSR) Markers Established in Europe as a Method for the Identification of Potato Varieties Grown in Canada

The correct identification of potato varieties is crucial to maintaining the quality level of seeds produced under the Canadian Seed Potato Certification Program. During inspection of in vitro potato plant propagation centres or seed potato production field lots, morphological characteristics may not be sufficient for the identification of plantlets or tubers and therefore molecular identification is sought by inspectors for variety confirmation. With international harmonization of testing methods in mind, we proposed to evaluate further the microsatellite (SSR) markers established successfully by Reid et al. (2009, Euphytica 182: 239–249, 2011), using the reference potato variety DNA collection at the Canadian Food Inspection Agency (CFIA) established and currently used for Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) genotyping. The SSR markers developed by the European community laboratories were successfully validated by and established within the CFIA laboratory. Most genotypes generated for a set of 34 varieties were identical between the 2 laboratories with only 3 discrepancies due to the different interpretation of the presence/absence of the alleles. When used with potato reference DNAs of the CFIA collection, the method successfully differentiated 217 varieties apart but 10 groups, which are most likely clonal variants, were not discriminated. The SSR markers were successfully used to address 5 potato variety verification requests from CFIA inspectors during field inspections for seed potato certification. The markers successfully confirmed the presence of rogue varieties in 4 of these requests, therefore fulfilling the CFIA’s mandate towards stakeholders of the Canadian potato industry in preserving the quality of certified seeds.     

红麻种质资源遗传多样性和分子鉴定技术研究I．红麻AFLP—银染技术和种质资源指纹图谱的构建

通过摸索和优化实验条件，建立了红麻的AFLP—银染实验体系，获得了清晰的红麻种质资源AFLP指纹图谱。通常不同品种的红麻种质资源在形态特征上差异很小，但AFLP—银染技术检测到不同来源和不同品种的在红麻种质资源中存在较大的遗传差异。这一技术对红麻种质资源的鉴定和遗传多样性的检测非常有效。     

小麦BNS雄性不育中国春恢复基因的连锁群检测和QTL初步定位

BNS是一个新发现的温敏小麦雄性不育系,有良好的不育性和自身转换性,在杂交小麦利用和不育资源研究中有重要价值。为定位BNS的恢复基因,首先以BNS的高恢复系中国春为材料,创建BNS×中国春F2作图群体,建立自交结实率和花粉可育率两个表型BSA池;然后用中国春缺体-四体系检测恢复相关连锁群;最后用这些连锁群上的SSR分子标记筛选BSA池,用检测的连锁标记筛选F2作图群体,进一步定位恢复基因的QTL位点。结果表明,用BNS与中国春缺四体杂交,根据F1不育性检测到4个相关连锁群,分别是1A、1B、2B和7B;利用4个相关连锁群和4个非相关连锁群共8个染色体上的222对SSR分子标记筛选2对共4个BSA池,结果在3个相关连锁群上检测到8对连锁标记;用这8对连锁标记筛选F2群体210个个体植株,检测到5个QTL位点,位于1A、1B和2B染色体上。这些位点中,1个与自交结实率相关,2个与两个表型均相关,是主效QTL位点,另2个与花粉可育率相关,是微效QTL位点。这些结果为BNS恢复基因分子标记选择和精细定位奠定了基础。     

芸薹种UGMS标记及抗根肿病基因连锁标记的定位

为定位芸薹种抗根肿病基因的连锁标记,利用芸薹种单一基因微卫星(UGMS)标记及基因组SSR和抗根肿病(clubroot resistance,CR)基因的紧密连锁分子标记,构建了结球白菜59-1×芜菁(CR)WJ04遗传连锁图谱,对芜菁WJ04和结球白菜59-1进行根肿病抗性鉴定和连锁位点分析。结果表明:抗根肿病芜菁自交系WJ04对来自我国根肿病主要疫区的4个根肿菌生理小种2、4、7和10均具有显性抗性,而59-1则均表现为感病。UGMS标记在大白菜和芜菁亚种间的多态性比率为30.1%,低于基因组SSR的50.8%;图谱覆盖长度为1 116.2cM,包含分布在10条连锁群的59个UGMS、72个基因组SSR和4个分别与CR基因Crr1、Crr2、Crr3和CRb连锁的标记。     

甘蓝型油菜MI CMS恢复基因的RAPD标记

以MI CMS育性分离群体(宁A6/宁R1)F2为基础群体,结合BSA法,利用500条10bp的随机引物对不育与可育DNA池进行筛选,存在差异的引物再对分离群体进行检测,获得了与MI CMS恢复基因Rfm连锁的RAPD标记2个,即:OPH1590和OPS7380.他们位于恢复基因的两侧,遗传图距分别为5.6cM和17.3cM.