ROCK选择性抑制剂Y-27632提高小鼠胚胎干细胞传代效率研究

以小鼠胚胎干细胞(ES细胞)为研究对象,探讨ROCK选择性抑制剂Y-27632在细胞传代过程中的作用,并对ES细胞相关生物学特性进行检测。结果表明:Y-27632能够引起ES细胞形态发生改变,通过Y-27632的添加能够使质地紧密的ES细胞集落变得松散、扁平。将Y-27632应用于ES细胞传代,能够显著提高传代效率。并且,在Y-27632长期存在的条件下,ES细胞依旧维持稳定的染色体数目,较强的碱性磷酸酶活性,在体内能够分化形成畸胎瘤,在体外能够分化形成心肌细胞。说明Y-27632的使用能够显著提高小鼠ES细胞的传代效率;紧密的细胞连接不是维持ES细胞多能性的必要条件。     

牛磺酸对昆明小鼠早期胚胎体外发育和着床的影响

本研究主要探讨了牛磺酸对昆明(KM)小鼠体外胚胎发育及对胚胎着床的作用。在mKSOM(modified potassium simplex optimized medium)胚胎体外培养液中分别添加不同浓度牛磺酸,培养24、72 h后分别统计4-细胞率、囊胚率、囊胚总细胞数;采用子宫角注射的方法,研究牛磺酸转运抑制剂β-丙氨酸对孕D9胚胎着床数的影响。结果表明,添加10 mmol/L牛磺酸培养液组的胚胎4-细胞率高于对照组(P<0.05),囊胚率与囊胚总细胞数明显高于对照组(P<0.01)。子宫角注射β-丙氨酸(20 μg/mL)显著降低D9着床的胚胎数。本研究初步明确了牛磺酸对小鼠体外胚胎发育及对胚胎着床的影响,为进一步研究胚胎发育和着床提供参考。     

不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

[目的]系统比较了在成熟培养液中添加Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚的发育率和囊胚质量,同时比较了成熟培养液和胚胎培养液添加Leptin对孤雌激活胚发育的影响。[方法]成熟培养液中添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目,并且研究了成熟培养液和胚胎培养液单独或联合添加Leptin对猪早期孤雌胚胎发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目。[结果]成熟培养液中添加不同浓度Leptin(0,10,50,100和200 ng/ml),体外成熟44 h,卵母细胞核成熟率统计分析差异不显著(P>0.05);将核成熟卵母细胞进行化学激活,第2天胚胎卵裂率统计分析差异不显著(P>0.05),但100ng/ml组与其他组第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数差异显著(P<0.05);成熟液添加Leptin 100 ng/ml、胚胎培养液添加Leptin 10 ng/ml与其他组第7天的囊胚率及囊胚的内细胞团细胞数差异显著(P<0.05)。[结论]Leptin对卵母细胞成熟和孤雌胚胎发育能力上有相辅相成的作用。     

不同培养体系对绵羊体外受精胚胎发育及细胞凋亡的影响

[目的]通过SOFaaBSA和CR1 aaBSA - FBS两种培养液对体外胚胎发育率及胚胎凋亡发生的影响,筛选适合绵羊体外受精胚胎发育的培养体系,为相关研究提供一定的理论依据和研究基础.[方法]采用激光共聚焦显微镜和细胞原位凋亡检测技术(TUNEL),分析这两种胚胎体外培养系统的绵羊体外受精胚胎发育的影响及各发育阶段的细胞凋亡状况及对胚胎发育的影响.[结果]SOFaaBSA和CR1aaBSA- FBS组的卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率均高与其它实验组,但这两组之间差异不显著(P＞0.05).同时,在两种培养液培养的2细胞、3-8细胞期的绵羊体外受精正常形态的胚胎中均未发现凋亡信号,凋亡信号在两种培养液中都是首次出现在9- 16细胞胚胎细胞中,并且随着胚胎发育至囊胚期,凋亡细胞效随着胚龄增长越来越多.在SOFaaBSA培养液培养的桑椹胚和囊胚细胞胚胎凋亡率显著低于CR1aaBSA - FBS培养液培养的桑椹胚和囊胚(P＜0.05),同时,在CR1aaBSA- FBS培养液中桑椹胚和囊胚细胞平均具有凋亡细胞的数量显著高于SOFaaBSA培养液(P＜0.05).[结论]CR1aaBSA- FBS培养系统显著的增加了绵羊晚期体外胚胎的凋亡.CR1 aaBSA - FBS能够支持绵羊体外受精胚胎的发育,但SOFaaBSA培养液更适合绵羊体外胚胎的发育.     

壳寡糖对小鼠胚胎体外发育的影响

本研究旨在通过向小鼠体内受精和体外受精原核胚胎的培养基中添加壳寡糖(对照组:0μg·m L-1;试验组:5、10、50、100和200μg·m L-1),研究其对小鼠胚胎着床前发育效率(卵裂率、囊胚率)和囊胚质量(囊胚总细胞数、内细胞团数(ICM)与总细胞数的比率)的影响。结果表明,对于自然受精胚胎,添加10μg·m L-1壳寡糖组的囊胚总细胞数显著高于对照组(P0.05),添加200μg·m L-1壳寡糖组的卵裂率和囊胚率均显著低于对照组(P0.05)。对于体外受精胚胎,添加10μg·m L-1壳寡糖组的囊胚率显著高于对照组(P0.05),添加200μg·m L-1壳寡糖组的囊胚率显著低于对照组(P0.05)。本试验表明,在化学限定培养基中添加适量的壳寡糖有利于改善小鼠胚胎的质量,但高剂量的壳寡糖可能不利于小鼠胚胎的早期发育。     

巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对小鼠胚胎体外发育的影响

以小鼠自然受精与体外受精胚胎为模型,探索鼠源巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在小鼠胚胎早期发育过程中的生理功能。分别使用添加不同剂量(对照组:0 ng.mL-1;试验组:0.5、2和10 ng.mL-1)GM-CSF的化学限定培养基连续培养小鼠自然受精、体外受精原核期与2细胞期胚胎,检测其胚胎着床前发育效率(卵裂率、囊胚率)及囊胚的质量(囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率、凋亡指数)。结果发现,对自然受精胚胎而言,原核时期添加不同剂量的GM-CSF,其卵裂率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均差异不显著,但10 ng.mL-1试验组的囊胚率显著低于对照组(61.6±5.1)%(P0.05);2细胞时期添加不同剂量的GM-CSF,其囊胚率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均差异不显著,但试验组中的囊胚凋亡指数均显著低于对照组(P0.05)),并且试验组中2 ng.mL-1的囊胚凋亡指数最低,显著低于0.5 ng.mL-1(P0.05),其他试验组之间的囊胚凋亡指数没有统计学上的差异性。对体外受精胚胎来说,原核时期添加GM-CSF,其卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均无显著性差异;在2细胞时期,10 ng.mL-1组的囊胚率显著低于对照组及其他2个试验组(P0.05),但各组之间的囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率均无显著性差异。本研究结果表明,在化学限定培养基中添加一定剂量的GM-CSF有利于改善小鼠自然受精与体外受精囊胚的质量,但剂量过高可能不利于小鼠受精胚胎的早期发育。     

miRNA-145、Oct4和Sox2基因在小鼠早期胚胎发育分化中的表达情况

【目的】揭示miRNA-145、Oct4和Sox2基因与早期胚胎细胞表型间可能存在的关联,为阐明miRNA-145调控早期胚胎发育分化的分子机制奠定基础。【方法】利用手术法收集SPF级昆明小白鼠体内生产的2-细胞胚胎和囊胚,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小鼠2-细胞胚胎和囊胚中miRNA-145、Oct4和Sox2基因的表达情况。【结果】在小鼠早期胚胎由2-细胞胚胎发育至囊胚的过程中,miRNA-145在囊胚中的表达量显著高于在2-细胞胚胎中的表达量（P〈0.05,下同）,而Oct4和Sox2在囊胚中的表达量显著低于在2-细胞胚胎中的表达量。【结论】miRNA-145基因表达量上调与Oct4、Sox2基因表达量下调是随着小鼠早期胚胎发育分化的进行同时发生。     

TCZB培养液提高小鼠早期胚胎热耐受性的研究

【目的】研究改良的CZB培养液(TCZB)对小鼠早期胚胎发育的影响,寻找一种可以提高动物胚胎热耐受性的新型培养液。【方法】利用原核表达的方法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体—Tat-Hsp70,通过在CZB培养液中添加Tat-Hsp70蛋白,配制成TCZB培养液。比较热应激组及对照组胚胎发育率和囊胚孵出率的不同。【结果】小鼠胚胎经39℃热应激处理后,CZB组、TCZB组及对照组的囊胚发育率及囊胚孵出率无显著差异。41℃热应激处理后各组则有显著差异,对照组囊胚发育率及囊胚孵出率(83.7±6.1和75.6±4.5)显著高于TCZB组(81.3±4.5和76.5±7.6)(P0.05),TCZB组显著高于CZB组(80.2±5.4和73.4±6.2)(P0.05)。【结论】TCZB培养液可以提高小鼠早期胚胎在41℃强烈热应激条件下的发育率,提高小鼠胚胎的热耐受性。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异。[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比。[结果]该序列与牛核糖体蛋白L31（ribosomal protein L31,RPL31）基因序列具有99%的同源性。采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍。[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据。     

培养液充气时间对小鼠4细胞胚胎密闭培养效果的影响

【目的】研究标准气充气时间对密闭培养的小鼠4细胞胚胎体外发育的影响,为太空环境下哺乳动物的早期胚胎发育研究奠定基础。【方法】用气体组成为体积分数5%O_2、5%CO_2、90%N_2的高纯标准气对胚胎培养液进行充气处理,充气时间设为30,60,90,120,150,180和240 min,用充气培养液对小鼠4细胞胚胎进行密闭培养,以常规体外微滴培养的胚胎为对照,分别在培养12,36,60,84 h时检测各组体外培养胚胎过氧化物的积累情况和缺氧诱导因子(HIF-1α)表达的变化,并于培养84 h统计囊胚发育率、孵化率和囊胚总细胞数。【结果】当充气时间≥180 min时,胚胎发育早期存在明显的过氧化物积累现象;当充气时间≤120 min时,胚胎发育过程中可以检测到HIF-1α,表明出现缺氧现象。密闭培养条件下,培养液充气120～180 min时的小鼠胚胎囊胚发育率、孵化率和囊胚总细胞数较高,分别为93.38%～95.68%,61.03%～65.27%和102.33～111.83,其中囊胚发育率和囊胚总细胞数与对照组差异不显著(P0.05),而囊胚孵化率显著高于对照组(P0.05)。【结论】小鼠4细胞胚胎密闭培养体系适合的培养液充气方案为:用气体组成比例为体积分数5%O_2、5%CO_2、90%N_2的高纯标准气充气120～150 min,此方案下进行密闭培养的小鼠胚胎可获得较高的发育率,并可有效排除缺氧对早期胚胎体外发育的影响,同时保护胚胎免受过氧损伤。     

Nonsteroidal anti-inflammatory drugs can lower amyloidogenic Abeta42 by inhibiting Rho

A subset of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) has been shown to preferentially reduce the secretion of the highly amyloidogenic, 42-residue amyloid-beta peptide Abeta42. We found that Rho and its effector, Rho-associated kinase, preferentially regulated the amount of Abeta42 produced in vitro and that only those NSAIDs effective as Rho inhibitors lowered Abeta42. Administration of Y-27632, a selective Rock inhibitor, also preferentially lowered brain levels of Abeta42 in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Thus, the Rho-Rock pathway may regulate amyloid precursor protein processing, and a subset of NSAIDs can reduce Abeta42 through inhibition of Rho activity.     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5＇非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1 b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPaseRABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明,T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5′非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPase RABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

透明质酸对绵羊卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

[目的]探讨不同浓度透明质酸对绵羊卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育效果的影响。[方法]以绵羊卵母细胞为试验材料,分别在绵羊卵母细胞体外成熟和体外胚胎培养液中添加0、1.5、3.0、4.5 mg/ml的透明质酸（HA）,研究其对绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。[结果]当HA浓度为1.5和3.0 mg/ml时,绵羊卵母细胞的成熟率分别为72.54%和62.17%,显著高于对照（P〈0.05）。当HA浓度介于1.5～3.0 mg/ml时,HA对绵羊卵母细胞体外成熟有促进作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,绵羊卵母细胞的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组与其他组（P〈0.05）,囊胚细胞总数显著高于其他各组（P〈0.05）。这说明HA可以促进绵羊卵母细胞的早期胚胎发育。[结论]HA不仅可以促进绵羊卵母细胞成熟,而且在细胞分化中也会起作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,最有利于绵羊的早期胚胎发育。     

盐度和pH对长吻鮠胚胎发育的影响

[目的]解决长吻鮠养殖过程中受精率、孵化率、鱼苗成活率较低的问题。[方法]探讨了盐度和pH对长吻鮠胚胎发育的速度、器官分化、畸形率、死亡率的影响。[结果]盐度越高,长吻鮠胚胎的孵化率和存活率越低,发育速度越慢。原肠胚期和神经胚期是对盐度最敏感的时期。胚胎发育的最适盐度在6‰以下,最高临界盐度为11‰。氢离子浓度对胚胎的存活率和孵化率有明显的影响,但与胚胎发育速度关系不大。胚胎发育的适宜pH是7,最高临界pH为9,最低临界pH是5。[结论]该研究可为长吻鮠的进一步开发与利用提供依据。     

“胰岛素-转铁蛋白-硒钠”对山羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

[目的]为提高山羊卵母细胞及胚胎体外培养的效率,探索无血清体外培养体系。[方法]在目前卵母细胞体外成熟及胚胎培养所用的常规培养液中添加1%ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒钠)或以1%ITS分别替代2种培养液中FBS,对山羊卵母细胞及孤雌激活胚胎进行体外培养,检测ITS对其发育率的影响。[结果]添加ITS到卵母细胞成熟液中,对卵母细胞成熟率没有明显提高,但显著提高了其激活后孤雌胚胎的囊胚率(58.06%vs.48.19%);以ITS替代成熟液中FBS,取得了与FBS组相似的成熟率、卵裂率和囊胚率。添加ITS到胚胎培养液中,显著提高了山羊孤雌胚胎的囊胚率(68.30%vs.56.82%);以ITS替代胚胎培养液中FBS,卵裂率与FBS组无显著差异,囊胚率显著低于FBS组(42.33%vs.56.82%)。[结论]ITS对山羊卵母细胞体外成熟及胚胎早期发育均有促进作用;另外,ITS可以替代卵母细胞成熟培养液中的血清,作为无血清培养体系用于相关研究。     

“胰岛素-转铁蛋白-硒钠”对山羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响(英文)

[Objective] The research aimed to enhance culture efficiencies of oocyte and embryo of goat in vitro and to explore serum-free culture system in vitro.[Method] At present,the conventional solutions of oocyte maturation and embryo development in vitro were always added into 1% ITS(Insulin-transferrin-selenium) or using 1% ITS to replace FBS in 2 kinds culture solutions for conducting in vitro cultures of goat oocyte and parthenogenetic embryo.The influences of ITS on their developments were detected.[Result] ITS in maturation liquid of oocytes could not increase oocytes maturation rate but significantly increased blastocyst rate (58.06% vs. 48.19%)of parthenogenetic embryo.If FBS in maturation liquid of oocytes was replaced by ITS, the maturation rate, cleavage rate and blastocyst rate were basically unchanged.Adding ITS into embryo medium could increase blastocyst rate (68.30% vs. 56.82%)of parthenogenetic embryo of goat.If FBS in embryo medium was replaced by ITS,the cleavage rate didn’t change basically,while the blastocyst rate in ITS was obviously lower than that in FBS group(42.33% vs.56.82%).[Conclusion] ITS could promote maturation of oocyte in vitro and early embryonic development, in addition,ITS could replace serum in maturation medium of oocyte as serum-free culture system for conducting relevant researches.     

微滴中胚胎数量对猪孤雌胚早期体外发育的影响

[目的]优化猪早期胚胎培养体系,为单精子显微受精及体细胞核移植等研究提供依据。[方法]以猪的早期孤雌胚胎为材料,分别将人工激活后的70、50、30、15和5枚卵母细胞放入100μlNCSU-23培养液的微滴中进行培养,探讨了胚胎培养数量对猪早期孤雌胚发育的影响。[结果]100μl的培养微滴中培养30、50和70胚胎组,其分裂率分别为64.0%、65.2%和67.1%,显著高于5胚胎组,而与15胚胎组的差异不显著 在囊胚率方面,70胚胎组的最高,为3.0%,与50胚胎组的（1.7%）无显著差异,与5、15和30胚胎组的差异显著 各组的囊胚细胞数之间没有显著差异。[结论]在该研究条件下,当微滴体积为100μl时,培养50~70枚猪孤雌胚胎的效果最好,即,胚胎数∶培养滴体积=（1∶1.43~2.00）。     

滇重楼种子休眠机理研究

【研究目的】探讨滇重楼种子休眠机理,为打破种子休眠促进滇重楼实生育苗提供理论基础。【方法】采用重量法、胚率测定、ELISA等方法对种子吸水特性、萌发抑制物及种胚休眠与发育的内源机理进行了研究。【结果】种子不存在吸水障碍,与休眠无关;滇重楼种子中存在着萌发抑制物;滇重楼种子休眠属于形态学-生理学休眠类型;内源激素ABA和GA3在滇重楼种子休眠与萌发过程中起着重要作用,ABA是引起休眠的关键因素,ABA含量的降低是滇重楼种胚发育的始动因子,GA3有助于种子的生理后熟。【结论】滇重楼种胚发育不完全、种子中存在萌发抑制物质是种子休眠的主要原因。萌发抑制物的存在可能抑制了种胚发育,而与生理学后熟过程无关。在自然条件下,滇重楼生境中较长的低温时期可能是滇重楼种子具有较长时间休眠的外界原因。