不同源性H5亚型禽流感病毒株HA基因序列分析

本研究对1株鹅源和一株鸽源的H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行扩增、克隆和序列分析。结果表明，所扩增的片段长均为1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸；该毒株有7个潜在糖基化位点；在HA裂解位点附近有6个碱性氨基酸序列插入。两毒株间核苷酸与氨基酸的同源性均为96．7％。该毒株与参考毒株的序列比较分析结果表明：核苷酸同源率分别为95．3％～99％；氨基酸同源率分别为95．1％～99.3％。     

3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

对近10年来在同一地区分离到的3株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增和序列分析,探讨H9N2亚型流感病毒变异情况.3个毒株的HA基因全长1 683bp,编码560个氨基酸;其裂解位点均为R-S-S-R,属于低致病力毒株;推导的HA基因氨基酸序列均含7个相同的潜在糖基化位点,受体结合位点为禽源性流感病毒特异性序列,左侧臂氨基酸均为NGQQG,右侧臂均为GTSKA.3个分离株与参考株核苷酸与氨基酸同源率均较高,仅有一些非关键位点突变.它们均属欧亚种系,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97代表株亲源关系较近.研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异.     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株HA基因的克隆及序列分析

参照已发表的H5N1亚型禽流感的HA基因序列,设计了1对引物,对禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/3(H5N1)、A/Duck/XJ/4(H5N1)、A/CH/XJ/5(H5N1)、A/Goose/XJ/10(H5N1)和A/Duck/XJ/11(H5N1)进行RT-PCR扩增和克隆,获得了5个毒株的HA全长核苷酸序列,分别为1 779 bp、1 774 bp、1 776 bp、1 758 bp和1 740 bp序列分析表明,在HA切割位点处均有多个连续的碱性氨基酸(-R-E-R-R-R-K-K-R-)插入,具有高致病性禽流感病毒的特征.同源性分析表明,新疆分离株之间的核甘酸同源性在96.9%～98.8%;与来自青海湖斑头雁、广西天鹅、香港白鹭和台湾鸽等不同野禽毒株同源性为95.7%～100%;与来自香港、越南、浙江的人源禽流感毒株的同源性为95.2%～98.2%.     

禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析

以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物，对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT—PCR扩增，并将其克隆到pMD18-T载体上，分别获得了全长为817、851、854、854bp的全基因序列。序列分析结果表明，新疆毒株间的核苷酸同源性为97．8％～98．9%，氨基酸同源性为96．5％～98．7％，与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较，同源性为90．0％～99．4％；与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较，同源性为81．4％～99．3％。系统进化树分析表明，新疆株独立分支。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对3株H5N1亚型高致病性禽流感病毒新疆株的NA基因进行了扩增,分别得到了3个毒株的NA基因,序列分析表明,3个毒株NA的全长核苷酸序列均为1 380 bp.同源性分析表明,3个分离株之间的核苷酸同源性在95.1%～97.9%之间;与来自青海、浙江、广东、东南亚等不同地区水禽禽流感病毒毒株的同源性为90.3%～98.8%;与分离自香港、浙江、越南等地区的流感病毒同源性为86.7%～97.9%.     

一株H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传变异分析

对2006年采集的1份禽流感病鸡组织进行RNA抽提后,采用A型流感病毒通用引物进行禽流感病毒HA基因的扩增,并进行T载体克隆及测序,获得了一株H9亚型禽流感病毒的HA序列。序列分析表明,此血凝素基因的ORF由1683个核苷酸组成,编码560个氨基酸,属A／Chicken／Beijing／1／94系。将其在GenBank中Blasl后发现,其与1株珍珠鸡H9N2病毒（A／Guineafowl／Hongkong／NT101／03）和1株鸡H9N2病毒（A／Chicken／Hongkong／AP45／03）的同源性和分值最高,同源性可达97％,较中国2006年前的分离株进化相对稳定,核苷酸的变异不大。切割位点的序列为-PARSSRGLF-,仍属于低致病力毒株。但Gln226Leu的变异,使其成为一种潜在的可感染人的禽源毒株。     

1株H6N6亚型禽流感病毒贵州分离株HA和NA基因克隆与序列分析

为了解 H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的流行情况,本研究对2014年从贵州省三穗鸭体内分离鉴定出的1株H6N6亚型AIV (A/duck/Guizhou/013/2014) HA和NA基因进行了克隆和序列分析。结果显示,A/duck/Guizhou/013/2014的HA基因与华东地区2009年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达97.5%,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性AIV的分子特征;而NA基因则与福建2007年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达98.2%;由遗传进化树分析结果可知,HA和NA基因在遗传进化关系上,与湖南毒株位于同一分支,而与2007年贵州分离的3株H6N6亚型AIV不处于同一分支,说明A/duck/Guizhou/013/2014与本地区的H6N6亚型AIV亲缘关系较远。本研究结果表明当前贵州地区H6N6亚型AIV存在明显的遗传多样性。     

禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株.     

2株H3N8亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传变异分析

采用RT-PCR技术扩增了2株H3N8亚型流感毒株A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010的HA和NA基因,并与GenBank中收录的其他毒株序列进行比较分析和遗传进化分析.结果表明,分离株的HA与NA基因全长分别为1 733 bp、1 432 bp.A/du...     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

研究采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段,后连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector,转化JM109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段,并对目的片段进行测序,结果获得3个毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的都可达98％,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,这三个毒株均属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,三分离株的HA切割位点上均为-PARSSR-GLF-。所克隆的基因为珠海地区禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础。     

禽流感病毒株A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1基因的克隆及序列分析

参照GenBank公布的禽流感病毒基质蛋白M1基因序列,设计合成了1对特异性引物,采用RT-PCR法成功扩增并克隆了禽流感病毒M1基因。序列测定结果为M1基因cDNA全长759 bp,编码252个氨基酸。将其序列与数株甲型流感病毒M1基因序列进行比较,M1基因核苷酸同源性为99.1%~99.6%,推导氨基酸同源性为98.8%~99.6%,生物信息学分析表明,M1基因编码的蛋白质具有亲水性,有很强的抗原性,M1蛋白共有6个潜在的N-糖基化位点,可能存在3个蛋白激酶C磷酸化位点,存在2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因的克隆与原核表达

利用PCR技术亚克隆了H7亚型禽流感病毒的HA1基因,并将PCR产物连接到克隆载体pMD 18-T Simple vector,转化大肠杆菌。测序结果表明所克隆的片断大小为1035bp。将HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-HA1。将构建好的融合表达载体在IPTG的诱导下在大肠杆菌中得到了表达。融合蛋白GST-HA1的分子量为63ku。Western-Blot和ELISA鉴定结果表明,融合蛋白与H7亚型禽流感阳性血清发生特异性反应,而与H5、H9亚型抗血清不发生反应。     

猪流感病毒山东分离株H1N1亚型HA基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术对分离的H1N1亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物与pMD18-T载体连接,进行序列测定。同源性分析结果表明,分离毒株与其他H1N1亚型猪流感病毒的HA基因核苷酸同源性为70.7%～90.8%,与A/swine/Zhejiang/1/2007的同源性最高,与其他毒株的同源性相对较低。系统进化树分析结果表明,山东分离株的HA基因与欧洲谱系猪流感病毒进化关系最近,证明该分离株可能来源于北美谱系和欧亚谱系猪流感病毒的重组。     

13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的病原变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的13株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,13株病毒的HA基因在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类Y280-like亚分支,与A/DK/HK/Y280/97的HA基因核苷酸序列同源性为92.2%～97.6%,与中国最早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)相距较远,初步说明H9亚型禽流感病毒随着流行时间而发生了遗传分化。推测的HA糖基化位点的氨基酸序列12株病毒均与上述亚系相似,但有一株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上218～220位的一个潜在的糖基化位点。     

H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增H1N1亚型猪流感病毒广东分离株A／Swine／GuangDong／711／2001HA基因，对其进行了克隆和测序。结果显示，HA基因全长1771bp．共编码579个氨基酸。A／Swine／Guang Dong／711／2001HA基因编码的氨基酸序列中有8个糖基化位点，5个位于HAl基因的第27、28、40、104和287位点，3个位于HA2基因的21、153和213位点。与H1N1亚型猪流感经典毒株比较后发现，血凝素糖基化位点并不是高度保守的。将A／Swine／Guang Dong／711／2001与自Gen Bank读取的1918年人流感毒株A／South Carolina／1／18、1991年人流感毒株A／MD／12／91和1997年猪流感毒株A／Swine／Wisconsin／238／97等进行核苷酸同源性比较分析，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／SouthCarolina／1／18、A／MD／12／91和A／Swine／Wisconsin／238／97等毒株的核苷酸同源性分别为93．9％、94．7％和93．9％。从系统发生树来看，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／South Carolina／1／18和A／Swine／Wisconsin／238／97的亲缘关系相近。     

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建

采用RT－PCR技术扩增了禽流感病毒A／Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]神经氨酸酶（NA）基因，并将其克隆到pUC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸，从pUCNA中切下NA基因片段，将其亚克隆到质粒pSY538的EcoR I位点，将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的Sma I位点，然后切下同位含有NA及LacZ基因的片段，再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的Not I位点，经限制性内切酶分析，PCR鉴定等，证明含有禽流感病毒NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功，从而为进一步筛选表达NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性鉴定了实验基础。